El impacto del embarazo y la hipertensión asociada al embarazo en la reactividad de la arteria miometrial uterina humana

Los experimentos propuestos aquí buscan identificar los mecanismos subyacentes a los cambios en la reactividad de la arteria miometrial uterina humana durante el embarazo. La primera serie de experimentos será abordar los cambios que se han observado en las relaciones tensión-deformación y remodelación arterial durante el embarazo. La segunda serie de experimentos abordará la dependencia endotelial de la vasoconstricción aumentada inducida por el embarazo en las arterias miometriales durante el embarazo. Finalmente, la tercera serie de experimentos abordará la relación única entre el potencial de membrana en reposo, la señalización de calcio (Ca2+) y la reactividad vascular en las arterias miometriales de mujeres embarazadas y no embarazadas.

Extracción de sangre Se recolectarán muestras de sangre venosa de todos los pacientes para medir los niveles de hormonas circulantes y marcadores inflamatorios, de modo que los cambios de reactividad vascular relacionados con estos componentes puedan controlarse adecuadamente para caracterizar correctamente cambios similares atribuidos al embarazo y/o exposición. al estrés hipertensivo.

Muestras de recolección de tejido/líquido amniótico de la cesárea: este protocolo de investigación incluirá la recolección de las siguientes muestras en el momento de la cesárea: muestra de líquido amniótico, membranas fetales y biopsia placentaria, y una muestra de biopsia uterina de espesor total. No existen riesgos asociados con la recolección de líquido amniótico en el momento de la histerotomía/amniotomía durante una cesárea o la recolección de la placenta y las membranas fetales desechadas de otro modo. Generalmente, el riesgo de tomar las muestras de biopsia uterina no es mayor que el de una cesárea sola. En este momento, no hay riesgo conocido de la pequeña cantidad de tejido que se tomará para la biopsia. Puede ocurrir un ligero aumento en la incidencia y magnitud del sangrado. La realización de estos procedimientos bajo observación directa limita aún más este riesgo de hemorragia. La obtención de esta muestra uterina agregará solo un tiempo de operación mínimo y todos los médicos con capacitación en obstetricia y ginecología deberían poder realizar este procedimiento fácilmente. Se incluye para su revisión una copia del consentimiento informado vigente, así como un protocolo de biopsia formal que detalla el procedimiento, el sitio de la muestra, el tamaño de la muestra, el almacenamiento, etc. para completar la recolección de tejido en el momento de la cesárea.

Muestras de miometrio de histerectomía electiva: Estas pacientes se someterán a una histerectomía electiva que es independiente de nuestro estudio. El personal de investigación aislará la muestra de tejido después de la extirpación quirúrgica del útero. Se ha incluido para su revisión una copia del consentimiento informado vigente para nuestro estudio propuesto, así como un protocolo formal que documenta las instrucciones para completar la recolección de tejido en el momento de la histerectomía electiva benigna.

Análisis de laboratorio Tras la adquisición de las muestras de tejido recolectadas, el tejido se colocará inmediatamente en contenedores de solución salina fisiológica fría (PSS) hasta que se pueda organizar el transporte al laboratorio de la Universidad de Midwestern. Al llegar al laboratorio, se disecarán arterias miometriales y placentarias de tamaño resistente (~250 micrómetros) en solución salina fisiológica fría aireada con gas que contiene 21 % de oxígeno (O2), 74 % de nitrógeno (N2) y 5 % de dióxido de carbono ( CO2).

Se diseccionará una longitud de 1-2 mm, se limpiará el tejido conjuntivo y se transferirá al pozo de un arteriógrafo de 2 ml. Las arterias se canulan en un extremo, se aseguran con sutura, se limpian suavemente de sangre y luego se canulan en el extremo distal. Los datos se registran de forma continua utilizando un software de adquisición de datos (IonOptix Inc., Milton, Massachusetts, Estados Unidos de América).

Un servosistema de presión conectado a la cánula proximal mantiene una presión intraluminal estable. Las arterias presurizadas se superfunden continuamente con solución salina fisiológica (8-10 mililitros/minuto) aireada con gas que contiene 21 % de O2, 74 % de N2 y 5 % de CO2 a 37 Celsius (C). Después del equilibrio durante 120 min para obtener un diámetro de la luz basal (LD) estable, la arteria miometrial se contraerá con cloruro de potasio (KCl) 50 milimolar (mM) y en presencia de KCl 50 mM, se dilatará con bradicinina (1 micromolar ( uM)) para demostrar el músculo liso vascular intacto (VSM) y la función endotelial, respectivamente. Los vasos que no muestren constricción inducida por KCl y/o respuestas dependientes del endotelio se excluirán de estudios posteriores. Al final de cada experimento, se determina el diámetro pasivo del vaso exponiendo el vaso a PSS sin Ca2+ y diltiazem (80 mM), un inhibidor del canal de Ca2+ de tipo L.

Las constricciones inducidas por la presión (PIC, 10 a 100 mmHg) se expresan como una disminución porcentual del diámetro completamente dilatado de las arterias individuales a la misma presión intravascular. Los valores de diámetro se analizarán como porcentaje de constricción o porcentaje de inversión en el tono. Estos valores se obtendrán mediante las siguientes ecuaciones: % constricción = [(diámetro pasivo - diámetro activo) / diámetro pasivo] X 100]; donde pasivo representa el diámetro pasivo de la arteria en PSS sin Ca2+ que contiene diltiazem 80 mM, y el diámetro activo representa el diámetro de la arteria en respuesta en PSS que contiene Ca2+. Los experimentos restantes se realizarán a una sola presión intraluminal de 60 milímetros de mercurio (mm Hg). Siempre que sea posible, el diámetro vascular se determinará simultáneamente con [Ca2+] y/o registros electromiográficos (Em) intracelulares.

Diseño experimental para evaluar el efecto de los siguientes inhibidores sobre la constricción inducida por presión: L-NAME (L-nitro arginina metil éster; para inhibir NOS), Indometacina (INDO, para inhibir ciclooxigenasa (COX)), GM6001 (para inhibir metaloproteinasas de matriz (MMP)) e inhibidores de los canales de potasio (K+) en la constricción inducida por presión. Después de confirmar la viabilidad de la arteria miometrial, la arteria miometrial se presurizará a 60 mm Hg, se incubará durante 30 minutos en presencia de uno de los inhibidores anteriores y se evaluará la constricción inducida por presión (PIC). La respuesta del vaso en presencia del inhibidor se analizará para PIC como se describe anteriormente y el efecto del inhibidor comparando las respuestas vasculares en su presencia frente a su ausencia.

Estrés frente a tensión: se examinará la contribución de elastina y colágeno en la arteria miometrial (MA) para determinar si los cambios en la estructura de la pared arterial contribuyen al desplazamiento hacia la izquierda observado en nuestros datos preliminares. Estos experimentos se realizarán de manera similar a la descrita por Briones y colegas. Dado que muchas de las MMP (MMP 1, 8 y 12) actúan como colagenasas o elastasas, esto evaluará la contribución de las MMP en AM embarazadas y no embarazadas utilizando el inhibidor de MMP no específico, GM600157. Brevemente, después de obtener curvas de presión de control a presiones intraluminales de 10 mmHg a 140 mmHg a 37 °C, en una solución de Krebs que contiene Ca2+ 0 mM, los tejidos volverán a una presión intraluminal de 60 mmHg, reintroducidos en Krebs que contienen Ca2+ que contienen elastasa. , colagenasa o el inhibidor de MMP no específico GM6001 durante 60 minutos, luego se devuelve a una solución de Krebs que contiene Ca2+ 0 mM más el inhibidor durante 20 minutos, y se volverán a evaluar las curvas de presión. Las curvas de presión en ausencia y presencia de inhibidores se compararán calculando el grosor de la pared del vaso (WT) y el cambio de tensión de la pared (delta-T). Utilizando el software de detección de bordes y confirmado por técnicas histológicas, el WT se calculará como (diámetro exterior - diámetro interior)/2; donde WT representa el grosor de la pared (uM) y el diámetro exterior y el diámetro interior representan el diámetro exterior e interior arteriolar, respectivamente (micrómetro). Como describen Phillips et. al.63, delta-T se calculará como -1.333 X presión intraluminal (PIL) X [(0,5 X diámetro interno activo) - (0,5 X diámetro interno pasivo)] X 0,0001; donde delta-T (dinas/cm) representa la diferencia en la tensión de la pared entre las condiciones "pasiva" (PSS libre de Ca2+) y "activa" (PSS que contiene Ca2+) a una presión intraluminal dada (PIL; mmHg), y la las constantes 1,333 y 0,0001 son factores para convertir la presión en mmHg a dinas/centímetro cuadrado y de µm a cm, respectivamente. Como tal, delta-T representa el valor absoluto que describe la cantidad en la que aumentaría la tensión pasiva en la pared vascular si se inhibieran todos los mecanismos contráctiles activos a una presión intraluminal determinada. Finalmente, para confirmar los estudios funcionales, se emplearán enfoques histológicos y de biología molecular para evaluar la expresión de proteínas. El grosor de la pared arterial y la tensión de la pared se evaluarán en todos los experimentos.

Medición de Ca2+ en la pared arterial: Para controlar los cambios en el Ca2+ citosólico, la arteria miometrial se montará en una arteriografía de 2 mililitros (mL0) y se dejará que se equilibre como se describe anteriormente. La carga de células endoteliales se logrará mediante la perfusión intraluminal de la arteria con Fura-2 (2 micro-M) y ácido plurónico (0,05 %) durante 5 min a temperatura ambiente. La luz se enjuagará inmediatamente con PSS durante 10 minutos adicionales para eliminar Fura-2 de la luz y evitar la carga de células de músculo liso vascular. La carga de células de músculo liso vascular se logrará colocando Fura-2 (2 micro-M) en la cámara del vaso a temperatura ambiente durante 30 min. Después de enjuagar con PSS, se permitirá que el recipiente se vuelva a equilibrar durante 30 minutos a 37 grados centígrados, lo que permitirá que Fura-2 se desesterifique. La especificidad de las cargas del músculo liso y endotelial se determinará usando bradicinina 1 micro-M y KCl 50 mM. Si el endotelio se ha cargado satisfactoriamente con Fura-2, la bradicinina provocará un aumento del Ca2+ de las células endoteliales y la dilatación arterial. Si el músculo liso se ha cargado satisfactoriamente con Fura-2, la bradicinina provocará una disminución del Ca2+ de la pared arterial y la dilatación subsiguiente. La adición de 50 mM de K+ contraerá el vaso y aumentará el Ca2+ de la pared arterial. El cambio relativo en el Ca2+ citosólico se controlará mediante un equipo de microfluorimetría IonOptix y los cambios en [Ca2+] se calcularán a partir de la relación de la señal de excitación de 340 nm/380 nm.

Electrofisiología: registros de la membrana intracelular: los segmentos de la arteria miometrial se canularán de manera similar al método descrito anteriormente. Las mediciones intracelulares se realizarán a través de la superficie adventicia con microelectrodos llenos de KCl 3 molar utilizando un electrómetro Duo 773. Los empalamientos exitosos se juzgarán sobre la base de una caída rápida del potencial al entrar en la celda, un nivel de ruido bajo y un cambio mínimo en la resistencia del electrodo y un potencial cero antes y después del empalamiento. Las señales se verán en un osciloscopio digital (Hitachi), se grabarán y almacenarán para su reproducción posterior mediante el software de análisis/adquisición IonOptix.

Revisión de registros Tras la inscripción de los participantes, el investigador principal accederá a los registros médicos de cada sujeto del estudio. El participante recibirá un número de identificación del sujeto del estudio que se vinculará con el número de registro médico del paciente solo en la hoja de cálculo de Excel 'Lista maestra de participantes del estudio', mantenida en una unidad de bus serie universal encriptada y protegida con contraseña. Los elementos de datos relevantes luego se revisarán y resumirán en la hoja de cálculo de Excel de la 'Herramienta de recopilación de datos'.

Análisis de datos El análisis de datos será realizado por los investigadores del estudio con la asistencia del Departamento de Bioestadística de la Facultad de Medicina de la Universidad de Arizona - Phoenix. Las características de los sujetos se compararán mediante pruebas t o chi cuadrado y se informarán como media ± error estándar de la media (SEM) o intervalos de confianza del 95 %, según corresponda. Las mediciones de la contractilidad intrínseca de los vasos se compararán entre todos los grupos de sujetos en las diversas condiciones de estudio utilizando pruebas t, chi-cuadrado y análisis de regresión cuando corresponda. El análisis intermedio se llevará a cabo solo cuando se obtenga un tamaño de muestra de al menos 10 estudios completos para cada grupo (caso y control).