Внеклеточная ДНК как биомаркер после трансплантации легких

Хронические заболевания легких являются третьей ведущей причиной смерти в Соединенных Штатах. Трансплантация легких является эффективным краткосрочным вмешательством для некоторых пациентов с прогрессирующим заболеванием легких. По данным реестра Международного общества трансплантации сердца и легких (ISHLT) в 2014 г. было проведено около 4000 операций по пересадке легких у взрослых (1). Однако АР чаще встречается среди реципиентов легкого по сравнению с другими паренхиматозными органами, при этом примерно у 35% реципиентов легкого наблюдается по крайней мере один эпизод АР в течение первого года после трансплантации (1). Важно отметить, что АР является основным фактором риска хронической дисфункции аллотрансплантата; ведущая причина поздней смерти у реципиентов трансплантата легкого основное препятствие для улучшения долгосрочных результатов трансплантации легкого (2-5).

АР диагностируется при наблюдении периваскулярных или перибронхиолярных лимфоцитарных инфильтратов в трансбронхиальных биоптатах легкого (6). Предыдущие исследования показали, что даже эпизоды АР низкой степени тяжести (события АР минимальной или легкой степени тяжести) повышают риск хронической дисфункции трансплантата, однако большинство этих эпизодов протекают бессимптомно (4, 5). Таким образом, большинство центров трансплантации легких проводят контрольные биопсии легких с трехмесячными интервалами в течение первого года после трансплантации, а некоторые продолжают ежегодные контрольные биопсии в течение всего срока службы аллотрансплантата. Соответственно, реципиенты легких несут огромное бремя инвазивных процедур и неотъемлемые риски, связанные с этой практикой. Таким образом, существует острая неудовлетворенная потребность в создании менее инвазивного биомаркера АР, чтобы свести к минимуму количество биопсий после трансплантации легких.

Было высказано предположение, что повреждение аллотрансплантата легкого при АР разрушает эндотелиальный барьер, вызывая высвобождение донорской бесклеточной ДНК (dd-cfDNA) в кровоток реципиента (7). Эта гипотеза основана на исследованиях, устанавливающих dd-cfDNA в качестве полезного биомаркера АР у реципиентов трансплантата сердца (8). В частности, проспективное исследование реципиентов сердца показало, что dd-cfDNA облегчает диагностику АР с чувствительностью и специфичностью, сравнимыми с эндомиокардиальной биопсией (8). Аналогичным образом, экспериментальное исследование у небольшого числа реципиентов трансплантата легкого продемонстрировало значительное увеличение dd-cfDNA в связи с умеренным или тяжелым AR легких, а также предположило увеличение dd-cfDNA в связи с признаками хронической дисфункции трансплантата (9). Пробелы в этой предыдущей работе заключаются в определении полезности dd-cfDNA в качестве биомаркера для легких/минимальных событий АР, которые встречаются гораздо чаще, чем умеренные/тяжелые АР, и вызывают аналогичное увеличение риска хронической недостаточности трансплантата. Кроме того, в предыдущих работах не пытались понять, может ли dd-cfDNA коррелировать с ответом на лечение при AR или может ли dd-cfDNA быть обнаружена в жидкости аллотрансплантата легких. Таким образом, остается неизвестным, может ли легочная жидкость, полученная через БАЛ, быть более чувствительной матрицей для выявления клинических событий у реципиентов легких.

РАБОТА С вкДНК НА СЕГОДНЯШНИЙ ДЕНЬ В МНОГОЦЕНТРОВОЙ КОГОРТЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЛЕГКИХ (CTOT-20) CTOT-20 — это финансируемое Национальным институтом здравоохранения США многоцентровое обсервационное когортное исследование, включающее реципиентов трансплантата легкого во время трансплантации с продольным наблюдением в течение примерно 5 лет. В исследовании приняли участие более 800 реципиентов легких с 2015 по 2018 год в пяти североамериканских центрах трансплантации легких. В рамках CTOT-20 образцы периферической крови, предусмотренные протоколом, собираются через 1, 3, 6, 9 и 12 месяцев после трансплантации. Все пять центров, участвующих в программе CTOT-20, придерживаются сходной клинической практики, требующей наблюдения за БАЛ и трансбронхиальной биопсии легких с интервалами, обычно соответствующими этим временным точкам сбора крови. Важно отметить, что все биопсии, выполненные у субъектов CTOT-20, оцениваются на наличие и тяжесть АР в соответствии с международными рекомендациями (6) опытным патологоанатомом в центре сбора, и эти результаты вводятся в eCRF CTOT-20. Таким образом, мы накопили уникальный биорепозиторий хорошо фенотипированных парных образцов плазмы и БАЛ от реципиентов трансплантата легких.

В рамках дополнительного исследования CTOT, финансируемого NIH, мы выделили общую вкДНК из 320 парных образцов плазмы и БАЛ у 126 участников CTOT-20. Большинство этих образцов было собрано в течение первых ~ 6 месяцев после трансплантации. В общей сложности 60 пациентов в этой когорте имеют по крайней мере один случай АР, все из которых минимальны или легки по степени тяжести. вкДНК выделяли с использованием автоматизированной системы очистки нуклеиновых кислот (Maxwell RSC, Promega). Было использовано до 1 мл плазмы или БАЛ. Выход вкДНК определяли количественно с использованием системы флуоресцентного красителя Quantifluor (Promega), и выделенную вкДНК хранили при -20°С. TapeStation был выполнен на вкДНК, выделенной примерно из одной трети образцов БАЛ. Этот ограниченный анализ предполагает, что большинство образцов БАЛ содержат в основном очень маленькие фрагменты ДНК без значительного загрязнения геномной ДНК.

Предыдущие исследования показали, что даже эпизоды АР низкой степени тяжести (события АР минимальной или легкой степени тяжести) повышают риск хронической дисфункции трансплантата, однако большинство этих эпизодов протекают бессимптомно (4, 5, 10). Таким образом, большинство центров трансплантации легких проводят контрольные биопсии легких с трехмесячными интервалами в течение первого года после трансплантации, а некоторые продолжают ежегодные контрольные биопсии в течение всего срока службы аллотрансплантата. Соответственно, реципиенты легких несут огромное бремя инвазивных процедур и неотъемлемые риски, связанные с этой практикой. Таким образом, существует острая неудовлетворенная потребность в создании менее инвазивного биомаркера АР, чтобы свести к минимуму количество биопсий после трансплантации легких.

В рамках текущего сотрудничества выделенная вкДНК от субъектов/образцов, описанных здесь (126 субъектов, 320 образцов БАЛ в паре с 320 образцами плазмы, всего 640 образцов), будет передана в CareDx для определения фракции дд-вкДНК с использованием платформы Allosure ( 11). Кроме того, поскольку вполне вероятно, что донор не всегда будет вносить меньший вклад в вкДНК БАЛ, мы просим CareDx выполнить геномное выравнивание парных образцов БАЛ и плазмы, чтобы сообщить о выборе неизвестного вкладчика, который, скорее всего, представляет донорскую фракцию. .

Результаты по фракции dd-cfDNA из переданных образцов будут возвращены в Duke для интеграции с клиническими данными и статистическим анализом, поддерживаемым нашей статистической группой CTOT-20, с обменом результатами в сотрудничестве с командой CareDx. Подробный план статистического анализа будет разработан в сотрудничестве с CareDx до анализа данных. В общем, наш аналитический подход к описательному и логическому анализу для рассмотрения основной гипотезы/результата будет следующим:

Для описательного анализа биопсии будут разделены на следующие группы в зависимости от времени измерения: от 20 до 60 дней / от 61 до 140 дней / от 141 до 220 дней /> 220 дней (примерно через 1, 3 и 6 месяцев после трансплантации). Чтобы описать распределение доли dd-cfDNA, будет вычислено среднее значение (стандартное отклонение), сводка из 5 чисел и децили уровней. Распределение доли уровней dd-cfDNA будет описано с использованием графика разделения времени по статусу AR и по типу трансплантата в моменты времени биопсии. Коэффициент корреляции Пирсона будет использоваться для описания корреляции между парной кровью и фракцией БАЛ dd-cfDNA.

Для логического анализа, чтобы проверить, повышена ли доля dd-cfDNA у пациентов с трансплантацией во время события AR, доля уровней dd-cfDNA будет смоделирована как функция статуса AR и времени после трансплантации с использованием линейного смешанного эффекта. модель со случайным пересечением и случайным наклоном во времени. Линейное смешанное моделирование будет использоваться для учета зависимостей в наблюдениях. Модель также будет скорректирована с учетом потенциальных искажающих факторов, включая тип трансплантата (вводится как бинарный показатель двустороннего или одиночного), время от трансплантации до биопсии (вводится как непрерывная ковариата, центрированная и масштабированная). Кроме того, одновременное заражение будет введено в модель в качестве бинарного индикатора. Модель будет подогнана дважды, один раз для плазмы и один раз для БАЛ.