폐 이식 후 바이오마커로서의 무세포 DNA

만성 폐질환은 미국에서 세 번째로 큰 사망 원인입니다. 폐 이식은 진행된 폐 질환이 있는 일부 환자에게 효과적인 단기 개입입니다. ISHLT(International Society for Heart and Lung Transplantation) 등록 데이터(1)에 따르면 2014년에 거의 4,000건의 성인 폐 이식 수술이 시행되었습니다. 그러나 AR은 다른 고형 장기 이식과 비교하여 폐 수용자에서 더 일반적이며, 폐 수용자의 약 35%가 이식 첫 해 내에 적어도 한 번의 AR 에피소드를 경험합니다(1). 중요하게도 AR은 만성 동종이식 기능 장애의 주요 위험 요소입니다. 폐 이식 수혜자의 만기 사망의 주요 원인 장기 폐 이식 결과 개선의 주요 장애물입니다(2-5).

AR은 경기관지 폐 생검 표본에서 혈관주위 또는 세기관지주위 림프구 침윤을 관찰할 때 구별됩니다(6). 이전 연구에서는 낮은 등급의 AR 사건(최소 또는 경미한 심각도의 AR 사건)도 만성 이식편 기능 장애의 위험을 증가시키는 것으로 나타났지만 이러한 에피소드의 대부분은 무증상입니다(4, 5). 따라서 대부분의 폐 이식 센터는 이식 후 첫 해 동안 3개월 간격으로 감시 폐 생검을 수행하고 일부는 동종이식의 수명 동안 연간 감시 생검을 계속합니다. 따라서, 폐 수혜자는 침습적 절차의 막대한 부담과 이 관행과 관련된 고유한 위험을 안고 있습니다. 따라서 폐 이식 후 생검 수를 최소화하기 위해 AR의 덜 침습적인 바이오마커를 확립하기 위한 중요한 미충족 요구가 있습니다.

AR에서 폐 동종이식편의 손상은 내피 장벽을 파괴하여 기증자 유래 무세포 DNA(dd-cfDNA)가 수혜자 순환으로 방출되도록 하는 것으로 제안되었습니다(7). 이 가설은 dd-cfDNA를 심장 이식 수혜자에서 AR의 유용한 바이오마커로 확립한 연구를 기반으로 합니다(8). 구체적으로, 심장 수용자에 대한 전향적 연구는 dd-cfDNA가 심내막 생검(8)에 필적하는 민감도 및 특이성으로 AR의 진단을 촉진하는 것으로 나타났습니다. 유사하게, 소수의 폐 이식 수혜자를 대상으로 한 개념 증명 연구에서는 중등도 또는 중증 폐 AR과 관련하여 dd-cfDNA가 크게 증가했으며 만성 이식편 기능 장애의 징후와 관련하여 dd-cfDNA 증가가 있음을 시사했습니다(9). 이 선행 작업의 차이는 dd-cfDNA를 경증/최소 AR 사건에 대한 바이오마커로 정의하는 데 있으며, 이는 중등도/심각한 AR보다 훨씬 더 일반적이며 만성 이식 실패에 대한 유사한 위험 증가를 부여합니다. 또한, dd-cfDNA가 AR의 치료 반응과 상관관계가 있는지 또는 dd-cfDNA가 폐 동종이식액에서 검출될 수 있는지 여부를 이해하려는 이전 작업은 없습니다. 따라서 BAL을 통해 얻은 폐액이 폐 수용자의 임상 사건을 감지하는 데 더 민감한 매트릭스인지 여부는 아직 알려지지 않았습니다.

다중 센터 폐 이식 코호트(CTOT-20)에서 현재까지 cfDNA에 대한 작업 CTOT-20은 NIH가 자금을 지원하는 다중 센터 관찰 코호트 연구로, 이식 당시 폐 이식 수용자를 등록하고 약 5년에 걸쳐 종단적인 후속 조치를 취합니다. 이 연구는 2015년부터 2018년까지 5개의 북미 폐 이식 센터에서 800명 이상의 폐 수용자를 등록했습니다. CTOT-20의 일부로, 이식 후 1, 3, 6, 9, 12개월에 프로토콜에 명시된 말초 혈액 샘플을 수집합니다. CTOT-20에 등록한 5개 센터는 모두 이러한 혈액 수집 시점에 일반적으로 해당하는 간격으로 감시 BAL 및 기관지 폐 생검을 요구하는 유사한 임상 치료 관행을 따릅니다. 중요한 것은 CTOT-20 피험자에 대해 수행된 모든 생검은 국제 지침(6)에 따라 수집 센터의 숙련된 폐 이식 병리학자에 의해 AR의 존재 및 중증도에 대해 평가되고 이러한 결과가 CTOT-20 eCRF에 입력된다는 것입니다. 따라서 우리는 폐 이식 수혜자로부터 잘 표현된 쌍 플라즈마 및 BAL 샘플의 고유한 생체 저장소를 확보했습니다.

NIH가 자금을 지원하는 CTOT 보조 연구의 일환으로 우리는 126명의 CTOT-20 참가자에 대한 320쌍의 혈장 및 BAL 샘플에서 총 cfDNA를 분리했습니다. 이 샘플의 대부분은 이식 후 처음 ~6개월 이내에 수집되었습니다. 이 코호트의 총 60명의 환자는 적어도 하나의 AR 이벤트를 나타내며, 모두 심각도가 최소이거나 경미합니다. cfDNA는 자동 핵산 정제 시스템(Maxwell RSC, Promega)을 사용하여 분리되었습니다. 최대 1ml의 혈장 또는 BAL이 사용되었습니다. cfDNA 수율은 Quantifluor(Promega) 형광 염료 시스템을 사용하여 정량화되었으며 분리된 cfDNA는 -20°C에서 보관됩니다. TapeStation은 BAL 샘플의 약 1/3에서 분리된 cfDNA에서 수행되었습니다. 이 제한된 분석은 대부분의 BAL 샘플이 게놈 DNA에 의한 심각한 오염 없이 매우 작은 조각 DNA를 포함하고 있음을 시사합니다.

이전 연구에서는 낮은 등급의 AR 사건(최소 또는 경증의 AR 사건)도 만성 이식편 기능 장애의 위험을 증가시킨다는 것을 입증했지만 이러한 에피소드의 대부분은 무증상입니다(4, 5, 10). 따라서 대부분의 폐 이식 센터는 이식 후 첫 해 동안 3개월 간격으로 감시 폐 생검을 수행하고 일부는 동종이식의 수명 동안 연간 감시 생검을 계속합니다. 따라서, 폐 수혜자는 침습적 절차의 막대한 부담과 이 관행과 관련된 고유한 위험을 안고 있습니다. 따라서 폐 이식 후 생검 수를 최소화하기 위해 AR의 덜 침습적인 바이오마커를 확립하기 위한 중요한 미충족 요구가 있습니다.

현재 협업을 위해 여기에 자세히 설명된 대상/샘플(126명의 대상, 320개의 혈장 샘플과 쌍을 이루는 320개의 BAL 샘플, 총 640개의 샘플)에서 분리된 cfDNA는 Allosure 플랫폼을 사용하여 dd-cfDNA 분획을 결정하기 위해 CareDx로 전송됩니다( 11). 또한 공여자가 항상 BAL cfDNA에 대한 기여도가 낮은 것은 아닐 가능성이 높으므로 CareDx가 BAL 및 혈장 샘플 쌍의 게놈 정렬을 수행하여 공여자 분획을 가장 잘 나타내는 알려지지 않은 기여자의 선택을 알릴 것을 요청합니다. .

전송된 샘플의 dd-cfDNA 부분에 대한 결과는 CareDx 팀과 협력 방식으로 결과를 공유하여 CTOT-20 통계 팀이 지원하는 임상 데이터 및 통계 분석과의 통합을 위해 Duke로 반환됩니다. 자세한 통계 분석 계획은 데이터 분석 전에 CareDx와 협력하여 개발됩니다. 일반적으로 기본 가설/결과를 해결하기 위한 설명 및 추론 분석에 대한 분석적 접근 방식은 다음과 같습니다.

기술 분석을 위해 생검은 측정 시간에 따라 다음 그룹으로 비닝됩니다: 20 ~ 60일 / 61 ~ 140일 / 141 ~ 220일 / >220일(이식 후 대략 윈도우 1, 3 및 6개월). dd-cfDNA의 분율 분포를 설명하기 위해 평균(표준 편차), 5개 숫자 요약 및 수준의 십분위수를 계산합니다. dd-cfDNA 수준의 분율 분포는 AR 상태별 및 생검 시점에 걸친 이식 유형별로 분할 시간 상자 그림을 사용하여 설명됩니다. Pearson의 상관 계수는 쌍을 이룬 혈액과 dd-cfDNA의 BAL 분율 사이의 상관 관계를 설명하는 데 사용됩니다.

추론 분석의 경우 AR 사건 당시 이식 환자에서 dd-cfDNA의 분율이 상승하는지 여부를 테스트하기 위해 선형 혼합 효과를 사용하여 dd-cfDNA 수준의 분율을 AR 상태 및 이식 후 시간의 함수로 모델링합니다. 랜덤 절편과 랜덤 슬로프가 있는 모델. 선형 혼합 모델링은 관찰의 종속성을 설명하는 데 사용됩니다. 이 모델은 또한 이식 유형(양쪽 대 단일의 이진 지표로 입력됨), 이식에서 생검까지의 시간(연속 공변량으로 입력됨, 중심 및 크기 조정됨)을 포함한 잠재적 교란 요인에 대해 조정됩니다. 또한 동시 감염은 이진 지표로 모델에 입력됩니다. 모델은 혈장에 대해 한 번, BAL에 대해 한 번, 두 번 적합합니다.