ADN libre de células como biomarcador después del trasplante de pulmón

La enfermedad pulmonar crónica es la tercera causa principal de muerte en los Estados Unidos. El trasplante de pulmón es una intervención eficaz a corto plazo para pacientes seleccionados con enfermedad pulmonar avanzada. Casi 4000 operaciones de trasplante de pulmón en adultos se realizaron en 2014 según los datos del registro de la Sociedad Internacional de Trasplante de Pulmón y Corazón (ISHLT, por sus siglas en inglés) (1). Sin embargo, la RA es más común entre los receptores de trasplantes de pulmón, en comparación con otros trasplantes de órganos sólidos; aproximadamente el 35 % de los receptores de pulmón experimentan al menos un episodio de RA en el primer año del trasplante(1). Es importante destacar que la AR es el principal factor de riesgo de disfunción crónica del aloinjerto; la principal causa de muerte tardía en los receptores de trasplantes de pulmón el principal obstáculo para mejorar los resultados del trasplante de pulmón a largo plazo(2-5).

AR se distingue por la observación de infiltrados linfocíticos perivasculares o peribronquiolares en muestras de biopsia pulmonar transbronquial(6). Estudios anteriores han demostrado que incluso los eventos de AR de bajo grado (eventos de AR de gravedad mínima o leve) aumentan el riesgo de disfunción crónica del injerto, aunque la mayoría de estos episodios son asintomáticos (4, 5). Como tal, la mayoría de los centros de trasplante de pulmón realizan biopsias pulmonares de vigilancia a intervalos de tres meses durante el primer año posterior al trasplante y algunos continúan con biopsias de vigilancia anuales durante la vida útil del aloinjerto. En consecuencia, los receptores de pulmón incurren en una enorme carga de procedimientos invasivos y los riesgos inherentes asociados con esta práctica. Existe una necesidad crítica insatisfecha, por lo tanto, de establecer un biomarcador menos invasivo de AR para minimizar el número de biopsias después del trasplante de pulmón.

Se ha propuesto que el daño al aloinjerto de pulmón en AR altera la barrera endotelial, provocando la liberación de ADN libre de células derivado del donante (dd-cfDNA) en la circulación del receptor (7). Esta hipótesis se basa en estudios que establecen dd-cfDNA como un biomarcador útil de AR en receptores de trasplante de corazón(8). Específicamente, un estudio prospectivo de receptores de corazón demostró que dd-cfDNA facilitó el diagnóstico de RA con una sensibilidad y especificidad comparables a las de la biopsia endomiocárdica(8). De manera similar, un estudio de prueba de concepto en un pequeño número de receptores de trasplante de pulmón demostró que el dd-cfDNA aumentó significativamente en asociación con AR pulmonar moderada o grave y también sugirió aumentos de dd-cfDNA en asociación con signos de disfunción crónica del injerto(9). Las brechas en este trabajo anterior radican en la definición de la utilidad de dd-cfDNA como biomarcador para eventos de RA leve/mínima, que son mucho más comunes que la RA moderada/grave y confieren un aumento similar en el riesgo de falla crónica del injerto. Además, ningún trabajo anterior ha buscado comprender si dd-cfDNA puede correlacionarse con la respuesta al tratamiento en AR o si dd-cfDNA puede detectarse en el líquido de aloinjerto de pulmón. Como tal, aún se desconoce si el líquido pulmonar obtenido a través de BAL puede ser una matriz más sensible para detectar eventos clínicos en receptores de pulmón.

TRABAJO EN cfDNA HASTA LA FECHA EN LA COHORTE DE TRASPLANTE DE PULMÓN MULTICENTRO (CTOT-20) CTOT-20 es un estudio de cohorte observacional, multicéntrico y financiado por los NIH que inscribe a receptores de trasplante de pulmón en el momento del trasplante con un seguimiento longitudinal durante aproximadamente 5 años. El estudio inscribió a más de 800 receptores de pulmón entre 2015 y 2018 en cinco centros de trasplante de pulmón de América del Norte. Como parte de CTOT-20, las muestras de sangre periférica exigidas por el protocolo se recolectan 1, 3, 6, 9 y 12 meses después del trasplante. Los cinco centros que se inscriben en CTOT-20 siguen prácticas de atención clínica similares que exigen biopsias pulmonares transbronquiales y BAL de vigilancia a intervalos que generalmente corresponden a estos puntos de tiempo de recolección de sangre. Es importante destacar que todas las biopsias realizadas en sujetos CTOT-20 son evaluadas por un patólogo experimentado en trasplante de pulmón en el centro de recolección para determinar la presencia y la gravedad de la AR de acuerdo con las pautas internacionales(6) y estos resultados se ingresan en el CTOT-20 eCRF. Como tal, hemos acumulado un biodepósito único de muestras emparejadas de plasma y LBA bien fenotipadas de receptores de trasplantes de pulmón.

Como parte de un estudio auxiliar de CTOT financiado por NIH, aislamos cfDNA total de 320 muestras emparejadas de plasma y BAL en 126 participantes de CTOT-20. La mayoría de estas muestras se recolectaron dentro de los primeros ~6 meses del trasplante. Un total de 60 pacientes en esta cohorte tienen al menos un evento AR representado, todos los cuales son de gravedad mínima o leve. El cfDNA se aisló utilizando un sistema automatizado de purificación de ácidos nucleicos (Maxwell RSC, Promega). Se utilizó hasta 1ml de plasma o BAL. Los rendimientos de cfDNA se cuantificaron utilizando el sistema de tinción fluorescente Quantifluor (Promega) y el cfDNA aislado se almacenó a -20 °C. TapeStation se ha realizado en el cfDNA aislado de aproximadamente un tercio de las muestras de BAL. Este análisis limitado sugiere que la mayoría de las muestras de BAL contienen fragmentos de ADN en gran parte muy pequeños, sin contaminación significativa por ADN genómico.

Estudios anteriores han demostrado que incluso los eventos de AR de bajo grado (eventos de AR de gravedad mínima o leve) aumentan el riesgo de disfunción crónica del injerto, aunque la mayoría de estos episodios son asintomáticos (4, 5, 10). Como tal, la mayoría de los centros de trasplante de pulmón realizan biopsias pulmonares de vigilancia a intervalos de tres meses durante el primer año posterior al trasplante y algunos continúan con biopsias de vigilancia anuales durante la vida útil del aloinjerto. En consecuencia, los receptores de pulmón incurren en una enorme carga de procedimientos invasivos y los riesgos inherentes asociados con esta práctica. Existe una necesidad crítica insatisfecha, por lo tanto, de establecer un biomarcador menos invasivo de AR para minimizar el número de biopsias después del trasplante de pulmón.

Para la colaboración actual, el cfDNA aislado de los sujetos/muestras detallados en este documento (126 sujetos, 320 muestras de LBA emparejadas con 320 muestras de plasma, 640 muestras en total) se transferirá a CareDx para la determinación de la fracción de dd-cfDNA utilizando la plataforma Allosure ( 11). Además, dado que es completamente plausible que el donante no siempre sea el menor contribuyente al BAL cfDNA, solicitamos a CareDx que realice una alineación genómica de las muestras de plasma y BAL emparejadas para informar la selección del contribuyente desconocido que probablemente represente la fracción del donante. .

Los resultados de la fracción de dd-cfDNA de las muestras transferidas se devolverán a Duke para su integración con los datos clínicos y el análisis estadístico respaldado por nuestro equipo estadístico CTOT-20 con el intercambio de resultados en colaboración con el equipo de CareDx. Se desarrollará un plan de análisis estadístico detallado en colaboración con CareDx antes del análisis de datos. En general, nuestro enfoque analítico para los análisis descriptivos e inferenciales para abordar la hipótesis/resultado principal será el siguiente:

Para los análisis descriptivos, las biopsias se agruparán en los siguientes grupos según el momento de la medición: 20 a 60 días / 61 a 140 días / 141 a 220 días / >220 días (aproximadamente con intervalos de 1, 3 y 6 meses posteriores al trasplante). Para describir la distribución de la fracción de dd-cfDNA, se calcularán la media (desviación estándar), el resumen de 5 números y los deciles de los niveles. La distribución de la fracción de los niveles de dd-cfDNA se describirá mediante un diagrama de caja de tiempo dividido por estado de AR y por tipo de trasplante en los puntos de tiempo de la biopsia. El coeficiente de correlación de Pearson se utilizará para describir la correlación entre la sangre emparejada y la fracción BAL de dd-cfDNA.

Para los análisis inferenciales, para evaluar si la fracción de dd-cfDNA está elevada en pacientes trasplantados en el momento de un evento de AR, la fracción de los niveles de dd-cfDNA se modelará como una función del estado de AR y el tiempo desde el trasplante mediante un efecto mixto lineal. modelo con una intersección aleatoria y una pendiente aleatoria en el tiempo. Se utilizará un modelo mixto lineal para tener en cuenta las dependencias en las observaciones. El modelo también se ajustará para posibles factores de confusión, incluido el tipo de trasplante (ingresado como un indicador binario de bilateral frente a único), el tiempo desde el trasplante hasta la biopsia (ingresado como una covariable continua, centrado y escalado). Además, la infección concurrente se ingresará en el modelo como un indicador binario. El modelo se ajustará dos veces, una para plasma y otra para BAL.