Cellefrit DNA som biomarkør efter lungetransplantation

Kronisk lungesygdom er den tredje hyppigste dødsårsag i USA. Lungetransplantation er en effektiv kortsigtet intervention til udvalgte patienter med fremskreden lungesygdom. Næsten 4.000 voksne lungetransplantationer blev udført i 2014 ifølge International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT) registerdata(1). AR er imidlertid mere almindelig blandt modtagere af lunge, sammenlignet med andre solide organtransplantater, hvor ca. 35 % af lungemodtagere oplever mindst én AR-episode inden for det første år efter transplantationen(1). Det er vigtigt, at AR er den vigtigste risikofaktor for kronisk allotransplantat dysfunktion; den førende årsag til sen død hos lungetransplantationsmodtagere er den primære hindring for forbedrede langsigtede lungetransplantationsresultater(2-5).

AR skelnes efter observation af perivaskulære eller peribronchiolære lymfocytiske infiltrater i transbronchiale lungebiopsiprøver(6). Tidligere undersøgelser har vist, at selv lavgradige AR-hændelser (AR-hændelser af minimal eller mild sværhedsgrad) øger risikoen for kronisk graftdysfunktion, men de fleste af disse episoder er asymptomatiske (4, 5). Som sådan udfører størstedelen af ​​lungetransplantationscentrene overvågningslungebiopsier med tre måneders intervaller gennem det første posttransplantationsår, og nogle fortsætter årlige overvågningsbiopsier over allotransplantatets levetid. I overensstemmelse hermed påføres lungemodtagere en enorm byrde af invasive procedurer og de iboende risici forbundet med denne praksis. Der er derfor et kritisk udækket behov for at etablere en mindre invasiv biomarkør for AR for at minimere antallet af biopsier efter lungetransplantation.

Det er blevet foreslået, at beskadigelse af lunge-allotransplantatet i AR forstyrrer endotelbarrieren, hvilket forårsager frigivelse af donorafledt cellefrit DNA (dd-cfDNA) i modtagerkredsløbet(7). Denne hypotese er baseret på undersøgelser, der fastslår dd-cfDNA som en nyttig biomarkør for AR hos hjertetransplanterede modtagere(8). Specifikt viste en prospektiv undersøgelse af hjertemodtagere, at dd-cfDNA lettede diagnosen AR med en sensitivitet og specificitet, der kan sammenlignes med endomyokardiebiopsi(8). Tilsvarende viste en proof-of-concept-undersøgelse i et lille antal lungetransplantationsmodtagere, at dd-cfDNA steg signifikant i forbindelse med moderat eller svær lunge-AR og antydede også dd-cfDNA-stigninger i forbindelse med tegn på kronisk graftdysfunktion(9). Huller i dette tidligere arbejde ligger i at definere nytten af ​​dd-cfDNA som en biomarkør for milde/minimale AR-hændelser, som er langt mere almindelige end moderate/svære AR og giver en tilsvarende stigning i risikoen for kronisk graftsvigt. Derudover har intet tidligere arbejde søgt at forstå, om dd-cfDNA kan korrelere med behandlingsrespons i AR, eller om dd-cfDNA kan påvises i lunge-allotransplantatvæsken. Som sådan forbliver det ukendt, om lungevæske, opnået gennem BAL, kan være en mere følsom matrix til påvisning af kliniske hændelser hos lungemodtagere.

ARBEJDE PÅ cfDNA TIL Dato i MULTICENTER LUNGETRANSPLANTKOHORT (CTOT-20) CTOT-20 er et NIH-finansieret, multicenter, observationelt kohortestudie, der indskriver lungetransplantationsmodtagere på transplantationstidspunktet med longitudinel opfølgning over cirka 5 år. Undersøgelsen indskrev over 800 lungemodtagere fra 2015 til 2018 på fem nordamerikanske lungetransplantationscentre. Som en del af CTOT-20 udtages protokolpligtige perifere blodprøver 1, 3, 6, 9 og 12 måneder efter transplantation. De fem centre, der tilmelder sig CTOT-20, følger alle lignende klinisk plejepraksis, der kræver overvågning af BAL og transbronkiale lungebiopsier med intervaller, der generelt svarer til disse blodopsamlingstidspunkter. Det er vigtigt, at alle biopsier udført på CTOT-20-personer vurderes for tilstedeværelsen og sværhedsgraden af ​​AR i henhold til internationale retningslinjer(6) af en erfaren lungetransplantationspatolog på opsamlingscentret, og disse resultater indføres i CTOT-20 eCRF. Som sådan har vi oparbejdet et unikt biodepot af godt fænotypeparrede plasma- og BAL-prøver fra lungetransplantationsmodtagere.

Som en del af et NIH-finansieret CTOT-undersøgelse isolerede vi totalt cfDNA fra 320 parrede plasma- og BAL-prøver på 126 CTOT-20-deltagere. Størstedelen af ​​disse prøver blev indsamlet inden for de første ~6 måneder efter transplantationen. I alt 60 patienter i denne kohorte har mindst én AR-hændelse repræsenteret, som alle er minimale eller milde i sværhedsgrad. cfDNA blev isoleret under anvendelse af et automatiseret nukleinsyreoprensningssystem (Maxwell RSC, Promega). Der blev brugt op til 1 ml plasma eller BAL. cfDNA-udbytter blev kvantificeret under anvendelse af Quantifluor (Promega) fluorescerende farvestofsystem, og isoleret cfDNA opbevares ved -20°C. TapeStation er blevet udført på cfDNA'et isoleret fra ca. en tredjedel af BAL-prøverne. Denne begrænsede analyse tyder på, at størstedelen af ​​BAL-prøverne stort set indeholder meget lille fragment-DNA uden signifikant kontaminering med genomisk DNA.

Tidligere undersøgelser har vist, at selv lavgradige AR-hændelser (AR-hændelser af minimal eller mild sværhedsgrad) øger risikoen for kronisk graftdysfunktion, men de fleste af disse episoder er asymptomatiske (4, 5, 10). Som sådan udfører størstedelen af ​​lungetransplantationscentrene overvågningslungebiopsier med tre måneders intervaller gennem det første posttransplantationsår, og nogle fortsætter årlige overvågningsbiopsier over allotransplantatets levetid. I overensstemmelse hermed påføres lungemodtagere en enorm byrde af invasive procedurer og de iboende risici forbundet med denne praksis. Der er derfor et kritisk udækket behov for at etablere en mindre invasiv biomarkør for AR for at minimere antallet af biopsier efter lungetransplantation.

For det nuværende samarbejde vil isoleret cfDNA fra de emner/prøver, der er beskrevet heri (126 forsøgspersoner, 320 BAL-prøver parret med 320 plasmaprøver, 640 prøver i alt) blive overført til CareDx til bestemmelse af dd-cfDNA-fraktionen ved hjælp af Allosure-platformen ( 11). Derudover, da det er fuldstændig plausibelt, at donoren ikke altid vil være den lavere bidragyder til BAL cfDNA'et, anmoder vi CareDx om at udføre genomisk justering af de parrede BAL- og plasmaprøver for at informere valget af den ukendte bidragyder, der højst sandsynligt repræsenterer donorfraktionen .

Resultater på fraktionen af ​​dd-cfDNA fra de overførte prøver vil blive returneret til Duke til integration med de kliniske data og statistisk analyse understøttet af vores CTOT-20 statistiske team med deling af resultater på en kollaborativ måde med CareDx-teamet. En detaljeret statistisk analyseplan vil blive udviklet i samarbejde med CareDx forud for dataanalyse. Generelt vil vores analytiske tilgang til de deskriptive og inferentielle analyser for at adressere den primære hypotese/resultat være som følger:

Til de beskrivende analyser vil biopsier blive inddelt i følgende grupper baseret på måletidspunkt: 20 til 60 dage / 61 til 140 dage / 141 til 220 dage / >220 dage (omtrent 1, 3 og 6 måneder efter transplantation). For at beskrive fordelingen af ​​fraktionen af ​​dd-cfDNA beregnes middelværdien (standardafvigelse), 5-talsoversigten og decilerne af niveauer. Fordelingen af ​​fraktion af dd-cfDNA-niveauer vil blive beskrevet ved hjælp af et split-time boxplot efter AR-status og efter transplantationstype på tværs af biopsitidspunkterne. Pearsons korrelationskoefficient vil blive brugt til at beskrive korrelationen mellem parret blod og BAL fraktion af dd-cfDNA.

Til slutningsanalyserne, for at teste, om fraktion af dd-cfDNA er forhøjet hos transplanterede patienter på tidspunktet for en AR-hændelse, vil en fraktion af dd-cfDNA-niveauer blive modelleret som en funktion af AR-status og tid fra transplantation ved hjælp af en lineær blandet effekt model med et tilfældigt skær og en tilfældig hældning til tiden. Lineær blandet modellering vil blive brugt til at tage højde for afhængigheder i observationerne. Modellen vil også justere for potentielle konfoundere, herunder transplantationstype (indgivet som en binær indikator for bilateral vs. enkelt), tid fra transplantation til biopsi (indført som en kontinuerlig kovariat, centreret og skaleret). Derudover vil samtidig infektion blive indtastet i modellen som en binær indikator. Modellen vil passe to gange, én gang til plasma og én gang til BAL.