Studio sul diabete di Durban: uno studio sull'epidemiologia del diabete mellito nei sudafricani urbani di origine africana (DDS) (DDS)

OBIETTIVI DI STUDIO

• Stimare la prevalenza del diabete mellito e dei fattori di rischio cardiometabolici e infettivi associati in questa popolazione
• Fornire approfondimenti eziologici sulla variazione dei fattori di rischio cardiometabolico e infettivo negli adulti utilizzando sia approcci genetici di popolazione che epidemiologici
• Per confrontare i test diagnostici per il diabete in questa popolazione
• Creare un quadro unico per la costruzione di uno studio trasversale su larga scala in una popolazione africana per esaminare un'ampia gamma di indici di salute e gettare le basi per ulteriori studi a lungo termine
• informare la politica sanitaria e i programmi di sanità pubblica volti ad affrontare l'aumento delle malattie non trasmissibili (NCD) in Sud Africa, che possono anche dare forma alle strategie di salute pubblica in altri paesi africani

PROGETTAZIONE DI STUDIO

Il DDS prevede una serie di fasi:

Fase 1: quadro di campionamento geografico Il comune di eThekwini (città di Durban) viene selezionato come quadro di campionamento iniziale e suddiviso in nove cluster di unità di pianificazione (PUC), che rappresentano nove comuni (Umlazi, Inanda, KwaMashu, Ntuzuma, Mpumalanga Complex, Cato Manor , Clermont, Lamontville e Chesterville) per una popolazione totale di circa 1.378.750 individui. Le strade vengono selezionate casualmente in ogni PUC in proporzione alla dimensione del PUC e alla proporzione di alloggi formali e informali in ogni PUC. Le famiglie sono selezionate mediante un sistematico campionamento a grappolo di abitazioni situate nelle strade selezionate in modo casuale.

Fase 2: Consapevolezza della comunità Una volta ottenuta l'approvazione etica locale dal Comitato etico per la ricerca biomedica presso l'Università di KwaZulu-Natal (UKZN) e ottenuto il supporto del Dipartimento provinciale della salute di KwaZulu-Natal, le autorità sanitarie locali e i leader della comunità di ciascuno dei nove PUC, sarà contattato per l'approvazione.

Fase 3: Iscrizione dei partecipanti Una volta che le aree PUC selezionate sono state sensibilizzate allo studio (fine della Fase 2), vengono nuovamente visitate dal team DDS. Durante questa fase il team DDS visita le famiglie nei quartieri selezionati e tutti i membri della famiglia che sono di origine africana, non incinta e di età pari o superiore a 18 anni sono invitati a partecipare allo studio. Il consenso è ottenuto dai residenti che accettano di partecipare. Tutti i residenti sono invitati a frequentare una sede centrale (ad es. centro/scuola della comunità locale) la settimana successiva in cui il team DDS raccoglie informazioni sui questionari sulla salute e sullo stile di vita, esegue semplici misurazioni biofisiche e raccoglie campioni di sangue e urine. Durante il reclutamento dei partecipanti nella comunità, il team DDS utilizza tecniche di mappatura del sistema di informazione geografica (GIS) per raccogliere dati geografici e di confine accurati sulle aree PUC selezionate.

Fase 4: raccolta di dati e campioni, test e analisi dei dati La raccolta di dati e campioni viene effettuata in mattine specifiche in una sede centrale. Questo è importante in quanto i partecipanti sono tenuti a digiunare durante la notte per un test di tolleranza al glucosio orale (OGTT). Il questionario e i dati biofisici dello studio vengono raccolti, archiviati elettronicamente e analizzati. I campioni di sangue e urina vengono trasportati all'Università di KwaZulu-Natal a Durban per la conservazione. I test di laboratorio vengono eseguiti presso un laboratorio privato. Alcuni campioni vengono inviati a centri specializzati nel Regno Unito, in Europa, negli Stati Uniti e in altri paesi per le analisi genomiche.

Fase 5: feedback dei risultati ai partecipanti allo studio A partire da otto settimane dopo la raccolta del campione, i risultati dei partecipanti saranno disponibili presso l'ufficio feedback del DDS. Tutti i risultati OGTT e lipidici verranno inviati ai partecipanti, a meno che non scelgano di non riceverli. Per ricevere tutti gli altri risultati (ad es. HIV, virus dell'epatite C [HCV], test di funzionalità epatica) i partecipanti devono fissare un appuntamento presso l'ufficio feedback DDS per raccogliere i loro risultati. Questo è facoltativo e i partecipanti che non desiderano ritirare i propri risultati possono scegliere di non contattare l'ufficio feedback DDS. Se appropriato, ai partecipanti che raccolgono risultati anormali o potenzialmente dannosi verrà consigliato di visitare la loro clinica o ospedale locale per ulteriori indagini e gestione come parte della loro cura clinica standard.

RACCOLTA DEI DATI E DEI CAMPIONI A. Raccolta dei campioni

1. Panoramica del campione di sangue Solo i partecipanti a digiuno sono idonei per la raccolta completa del campione di sangue. I partecipanti non a digiuno sono idonei solo per la raccolta del siero normale da 10 ml e dei quattro campioni di sangue di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). La venipuntura asettica viene eseguita da un'infermiera di ricerca registrata tramite un sistema di raccolta del sangue evacuato chiuso, utilizzando procedure standardizzate per ridurre al minimo il rischio di infezione.

2. Campioni di sangue richiesti Undici provette di sangue vengono raccolte da ciascun partecipante a digiuno: una provetta di siero normale da 10 ml, due provette di sangue intero EDTA da 10 ml, due provette di sangue intero EDTA da 2 ml e, per l'OGTT, tre provette di fluoruro di sodio (NaF) da 2 ml e tre provette di sangue di siero semplice da 2 ml. Pertanto, da ciascun partecipante viene prelevato un massimo di 46 ml di sangue venoso (circa tre cucchiai di sangue). Per i partecipanti non a digiuno, vengono raccolti solo un campione di siero semplice da 10 ml e i quattro campioni di sangue intero EDTA. Poiché il test HIV anonimo collegato viene effettuato come parte di questo studio, l'infermiere dello studio è formato nella consulenza sull'HIV e segue le linee guida nazionali pertinenti.

   Per i partecipanti a digiuno, l'OGTT da 75 g verrà eseguito come raccomandato dall'OMS. Le categorie di tolleranza al glucosio saranno conformi alla classificazione dell'OMS del 1998.

   La provetta per siero semplice da 10 ml viene utilizzata per testare il sangue per malattie infettive e biomarcatori cardiometabolici. La prima provetta di sangue intero EDTA da 10 ml viene spedita nel Regno Unito per l'analisi genetica. La seconda provetta di sangue intero EDTA da 10 ml viene sottoposta all'estrazione del plasma per il test della carica virale dell'HCV e l'estrazione dell'RNA. Le due provette per sangue intero EDTA da 2 ml vengono utilizzate rispettivamente per il test HbA1c e per l'emocromo completo.

   Test HIV anonimi collegati Come parte di questo studio, i partecipanti consenzienti saranno testati per l'HIV tramite test anonimi collegati. Ciò avverrà in conformità con le linee guida nazionali.

3. Raccolta del campione di urina Verrà prelevato un campione di urina puntuale (senza orario) per misurare il rapporto albumina-creatinina e il sodio e il potassio urinari.

B. Raccolta dei dati del questionario Una volta ottenuto il consenso appropriato e iniziata la raccolta del campione di sangue, i partecipanti si spostano alla postazione del questionario. Il questionario utilizzato in questo studio è un questionario elettronico (EQ) ed è un adattamento dello strumento standardizzato e convalidato WHO STEPwise approach to Surveillance (STEPS) progettato per la raccolta di fattori di rischio di malattie croniche, inclusi indici socio-demografici, stile di vita, malattie infettive fattori di rischio di malattia e storia cardiometabolica.

C. Raccolta di misurazioni biofisiche

I partecipanti allo studio si spostano alla stazione di misurazioni biofisiche che vengono eseguite utilizzando apparecchiature calibrate e convalidate. Le seguenti misure vengono prese utilizzando protocolli standardizzati:

• Altezza e peso (utilizzati per calcolare l'indice di massa corporea)
• Circonferenza vita e circonferenza fianchi (usati per calcolare il rapporto vita-fianchi)
• Circonferenza media della parte superiore del braccio
• Pressione sanguigna e frequenza cardiaca

ANALISI DEI CAMPIONI DI SANGUE

Tutti i campioni di sangue vengono analizzati per biomarcatori infettivi e cardiometabolici in un laboratorio privato a Durban. Verranno effettuati test HIV di conferma. Di seguito è riportato un elenco dei metodi di laboratorio utilizzati per i test sierologici e biochimici:

• Glicemia plasmatica: Metodo enzimatico, basato sugli enzimi esochinasi e glucosio-6-fosfato deidrogenasi
• Creatinina sierica: basata sulla reazione dell'acido picrico con la creatinina in un mezzo alcalino

• Lipidi sierici:

  • Colesterolo: Metodo enzimatico, che utilizza la conversione della colesterolo esterasi e della colesterolo ossidasi, seguito da un endpoint Trinder
  • Trigliceridi: basati sulla reazione enzimatica in tre fasi di Fossati con un endpoint Trinder. La procedura a singolo reagente quantifica i trigliceridi totali inclusi i mono- e di-gliceridi e le frazioni di glicerolo libero
  • HDL: reazione enzimatica basata sulle procedure sviluppate da Izawa, Okada e Matsui
  • LDL: Calcolato utilizzando la formula di Friedewald o il metodo enzimatico
  • Lipoproteina (a): Turbidometrica (Beckmann)
• HbA1c: cromatografia liquida ad alta prestazione. Strumento: BioRad Variante II
• HIV: ELISA di quarta generazione (Abbott Architect)
• Epatite B e C: ELISA

L'estrazione del DNA e dell'RNA avrà luogo presso l'Università di KwaZulu-Natal, l'Università di Cambridge, il Wellcome Trust Sanger Institute o una struttura di terze parti autorizzata nel Regno Unito. Il coordinatore dello studio è responsabile della spedizione dei campioni nel Regno Unito per l'estrazione del DNA e dell'RNA. Il DNA e l'RNA purificati vengono quindi inviati al Wellcome Trust Sanger Institute, nel Regno Unito, per l'analisi genetica.

ANALISI GENETICA

1. Panoramica Data la necessità di pipeline automatizzate su larga scala e tecnologia di sequenziamento e genotipizzazione Illumina di nuova generazione, tutta la genotipizzazione e il sequenziamento vengono eseguiti presso il Wellcome Trust Sanger Institute, Regno Unito (http://www.sanger.ac.uk/). Il Wellcome Trust Sanger Institute è un centro genoma internazionale con una vasta esperienza e competenza nella gestione di campioni di DNA e RNA provenienti da iniziative di ricerca genetica globali, inclusi sangue e campioni provenienti da diversi paesi dell'Africa subsahariana. È stato elaborato un accordo di trasferimento di materiale per la spedizione di campioni biologici nel Regno Unito.
2. Estrazione e quantificazione di DNA e RNA Il DNA e l'RNA vengono estratti presso l'Università di KwaZulu-Natal, l'Università di Cambridge, il Wellcome Trust Sanger Institute o da un fornitore di servizi di terze parti autorizzato nel Regno Unito, ad es. GenProbe, Manchester. Il DNA o RNA purificato viene quindi inviato al Wellcome Trust Sanger Institute. Tutto l'acido nucleico estratto viene quantificato mediante elettroforesi su gel o picogreen (per campioni di DNA) o ribogreen (per campioni di RNA) e quantificato rispetto a standard di concentrazione nota. Tutti i campioni di acido nucleico sono conservati presso il Wellcome Trust Sanger Institute in congelatori sicuri a -80 ˚C.

3 Genotipizzazione e sequenziamento Gli attuali array di diversità umana a livello di genoma non catturano sufficientemente gli alti livelli di diversità genetica e struttura della popolazione riscontrati nelle popolazioni africane, limitandone l'utilità. Pertanto, utilizzeremo il sequenziamento di nuova generazione, gli array di genotipizzazione e l'imputazione per aiutare a determinare l'associazione tra variazione genetica umana nella popolazione in studio e fattori di rischio quantitativi, malattie e diversità virale. Tutta la genotipizzazione e il sequenziamento vengono eseguiti presso il Wellcome Trust Sanger Institute. Inoltre, a causa degli enormi requisiti di archiviazione e cura dei dati genomici dal metodo di sequenziamento di nuova generazione, tutti i dati genomici grezzi vengono archiviati presso il Wellcome Trust Sanger Institute, nel Regno Unito.

4 Trasferimento, archiviazione e gestione dei dati Tutti i dati genomici grezzi saranno conservati presso il Wellcome Trust Sanger Institute, Regno Unito e l'Archivio europeo del genoma (EGA) presso il Laboratorio europeo di biologia molecolare-Istituto europeo di bioinformatica (EBI), Regno Unito.