Trattamento con eritropoietina e cognizione durante l'ipoglicemia

Protocollo sperimentale 6 giorni prima che i soggetti con morsetto ipoglicemico si presentassero alla clinica e sono state raccolte informazioni su demografia, stile di vita e caratteristiche cliniche. È stato eseguito un esame fisico con particolare attenzione alla possibile malattia tromboembolica. La pressione sanguigna è stata misurata due volte dopo 10 minuti di riposo in posizione seduta. Sono state valutate le misure della neuropatia periferica e autonomica ed è stato valutato visivamente un elettrocardiogramma (ECG) a 12 derivazioni. Lo stato di consapevolezza dell'ipoglicemia è stato classificato secondo Pedersen-Bjergaard et al [22]. Le frequenze degli episodi di ipoglicemia lieve e grave nella settimana precedente sono state registrate in un questionario. È stato montato un sensore per il monitoraggio continuo del glucosio (CGM) (Guardian® REAL-time, Medtronic Minimed, Northridge, USA). Successivamente, il soggetto è stato reintrodotto nel protocollo sperimentale e i test cognitivi sono stati addestrati due volte per evitare un effetto di apprendimento durante gli esperimenti. Infine, il farmaco in studio è stato iniettato per via endovenosa per quattro minuti. I soggetti sono stati istruiti a vivere e mangiare come facevano prima, per evitare qualsiasi esercizio rigoroso, uso di alcol e droghe psicoattive, per la settimana successiva. La calibrazione del CGM è stata effettuata dal paziente con il glucometro CONTOUR® LINK (Bayer Health Care, Leverkusen, Germania).

3 giorni prima dell'esperimento È stato inserito un nuovo sensore CGM ed è stato attivato un allarme di ipoglicemia. Poiché il valore della glicemia CGM è ritardato di circa 10 minuti rispetto alla glicemia plasmatica, il punto di allarme è stato impostato a 4,5 mmol/l. Sono stati scaricati i profili glicemici CGM per gli ultimi tre giorni per verificare se fosse necessario apportare modifiche al dosaggio di insulina per ridurre il rischio di ipoglicemia fino all'esperimento 3 giorni dopo. Infine, i soggetti hanno nuovamente allenato i test di funzione cognitiva.

Giorno dell'esperimento I soggetti sono arrivati ​​alle 8:00 in laboratorio dopo un digiuno notturno. I dati dal CGM sono stati scaricati. Se l'ipoglicemia, definita da almeno due valori CGM consecutivi inferiori a 3,5 mmol/l o un valore glicemico automonitorato inferiore a 3,5 mmol/l, si fosse verificata durante la notte precedente, l'esperimento è stato rinviato di almeno 14 giorni. Questo è stato il caso in un'occasione. Il CGM ha avvertito i partecipanti della riduzione della glicemia durante la notte prima dell'esperimento in tre occasioni prima che si verificasse effettivamente. In questi casi i partecipanti sono stati istruiti a consumare un pasto standard di 10 grammi di glucosio e 35 g di pane nero. Nessun partecipante aveva una glicemia CGM > 20 mmol/l durante la notte prima degli esperimenti.

Il soggetto è stato introdotto nel setting sperimentale ed è stato attrezzato come segue: 1) Una linea endovenosa antecubitale per l'infusione di insulina e glucosio e una linea il più distalmente possibile per il prelievo di sangue. Successivamente, la mano e il braccio sono stati posti sopra e sotto gli elettrodi riscaldati per arterializzare il sangue venoso; 2) cuffia EEG (elettroencefalografia), due riferimenti del lobo dell'orecchio e due derivazioni ECG precordiali collegate a un registratore EEG digitale (Cadwell, Kennewick, Washington, USA); 3) uno sfigmomanometro automatico (UA787, A&D Medical, Abingdon, UK). Successivamente, i soggetti si sono allenati ai test cognitivi.

L'esperimento è stato condotto in modo ciclico con un totale di tre cicli identici: un ciclo di base (euglicemia), un ciclo ipoglicemico e un ciclo di recupero (euglicemia). All'inizio di ogni ciclo veniva prelevato sangue venoso arterializzato. Successivamente, sono stati valutati i sintomi ipoglicemici seguiti dalla misurazione della pressione sanguigna e della frequenza cardiaca. Successivamente, la valutazione della funzione cognitiva è stata effettuata con il California Cognitive Assessment Package (CALCAP), un test di trail making e il test Stroop. Tutti i test cognitivi sono stati condotti nella stessa sequenza dalla stessa persona (PLK). Alla fine di ogni ciclo, sono stati eseguiti 5 minuti di registrazione EEG con gli occhi chiusi. Infine, è stato nuovamente prelevato sangue venoso arterializzato.

Procedura di clamp ipoglicemico L'insulina umana ad azione rapida (Actrapid®, Novo Nordisk, Bagsværd, Danimarca) miscelata con plasma eparinizzato del paziente e soluzione salina isotonica è stata infusa a una velocità di 1,0 mU x kg di peso corporeo-1 x min-1. La glicemia capillare è stata misurata al letto del paziente ogni 5 minuti e regolata con un'infusione variabile di glucosio al 20%. Il target ipoglicemico era 2,0 - 2,2 mmol/l. Durante i cicli euglicemici il target era di 5,0 mmol/l.

Punteggio dei sintomi ipoglicemici I sintomi ipoglicemici sono stati valutati dalla Edinburgh Hypoglycemia Scale, che è un questionario sviluppato per l'ipoglicemia indotta sperimentalmente in cui i soggetti devono indicare la gravità di 13 sintomi ipoglicemici predefiniti su una scala da uno a sette [23].

Test di funzionalità cognitiva California Cognitive Assessment Package (CALCAP) La versione danese del test Mini CALCAP (E.N Miller, California Cognitive Assessment Package, Norland Software, Los Angeles, 1990) viene eseguito sullo schermo di un computer e consiste in due diversi compiti sui tempi di reazione con differenti complessità: 1) un compito di reazione di scelta (RT1) con reazione a un numero specifico (sette) e 2) un compito di reazione di scelta (RT2) con reazione a due numeri identici in una sequenza (numeri mobili). Quest'ultimo test è un compito 1-back e include l'uso dell'attenzione sostenuta/memoria di lavoro.

Trail making test Il trail making test è un test di attenzione e funzione esecutiva [24]. Abbiamo utilizzato il percorso 5 del Comprehensive Trail-Making Test (Pro-ed, Austin, Texas, USA), che è organizzato come il test originale di trail making, parte B, sviluppato nel 1949, e ha aggiunto cerchi distrattori [24]. In questo test il soggetto deve collegare numeri e lettere cerchiati in sequenza alternata (es. 1-LA-2-SI-3-DO...). Il tempo per terminare il test è stato misurato in secondi.

Stroop Colour and Word Test Questo test misura l'attenzione selettiva e la flessibilità cognitiva [25]. Una versione danese della versione standardizzata di Golden [26] è stata utilizzata secondo il manuale di prova. Il test è composto da tre pagine, ciascuna con 100 item presentati in 5 colonne. Sulla prima pagina le parole "rosso", "verde" e "blu" sono stampate in nero e disposte in modo casuale. Sulla seconda pagina "XXXX" è stampato in rosso, verde o blu e disposto in modo casuale. Sull'ultima pagina le parole della pagina delle parole sono stampate in colori non corrispondenti alla pagina a colori. Nella prima e nella seconda pagina si suppone che il soggetto legga ad alta voce il colore degli oggetti. Sulla parola-colore-pagina il soggetto deve leggere il colore dell'inchiostro per ogni elemento. Viene registrato il numero di elementi durante un periodo di 45 secondi. Vengono presentati i punteggi grezzi.

Test neurofisiologici Elettroencefalografia (EEG) Un neurofisiologo specializzato nella lettura clinica dell'EEG (TWK) ha analizzato i dati EEG. È stato registrato un EEG continuo a 20 canali. I dati sono stati filtrati da un filtro low cut del primo ordine da 0,53 Hz e da un filtro high cut del primo ordine da 70 Hz. Tutti i dati sono stati ispezionati visivamente in un montaggio di riferimento del lobo dell'orecchio collegato. Per ogni soggetto è stato scelto l'elettrodo che fornisce la migliore rappresentazione dell'attività dominante per l'analisi spettrale di potenza, che è stata eseguita utilizzando la trasformazione veloce di Fourier (FFT) su epoche di 2,5 secondi (dando una risoluzione di 0,4 Hz nello spettro di potenza FFT). Se è stato possibile identificare un picco nello spettro di potenza nell'intervallo 4-13 Hz, è stato estratto come rappresentativo della frequenza dominante.