Immunogenetica della trombocitopenia indotta da eparina: obiettivo 2

Criteri di inclusione: 18 anni o più; Capacità di dare il consenso informato; Partecipanti con anticorpi eparina/PF4 e test SRA per HIT, tra cui:

partecipanti con anticorpi eparina/PF4 negativi e SRA negativi (controlli), partecipanti con anticorpi eparina/PF4 positivi e SRA negativi (casi di sieroconversione), partecipanti con anticorpi eparina/PF4 positivi e SRA positivi (casi HIT); Trattamento con eparina non frazionata o eparina a basso peso molecolare (enoxaparina, dalteparina, tinzaparina) entro 7 giorni dal prelievo di sangue

Criteri di esclusione: meno di 18 anni; Impossibilità di dare il consenso informato

Non è prevista alcuna randomizzazione in questo studio. I partecipanti saranno arruolati in numero uguale da tre categorie: (1) partecipanti senza test HIT negativi per anticorpi eparina/PF4 (controlli); (2) partecipanti senza test HIT positivi per anticorpi eparina/PF4 (casi di sieroconversione); (3) partecipanti con test HIT positivo per entrambi gli anticorpi eparina/PF4 (casi HIT).

Il reclutamento sarà facilitato attraverso collaboratori nel Dipartimento di Medicina Ematologia e attraverso il personale chiave dello studio nel Laboratorio di coagulazione clinica VUMC. I pazienti con risultati positivi e negativi per l'anticorpo eparina / PF4 e il test di rilascio della serotonina saranno identificati nel laboratorio di coagulazione clinica e il fornitore del paziente sarà contattato per la potenziale partecipazione a studi di ricerca. Se il potenziale partecipante è interessato, verrà contattato dal personale dello studio per la descrizione dello studio e l'eventuale consenso. In alternativa, i collaboratori clinici della Divisione di Ematologia che vengono consultati e partecipano direttamente alla cura di un paziente possono contattare direttamente un potenziale partecipante per la disponibilità a partecipare allo studio.

Ai pazienti che acconsentono allo studio verrà chiesto di fornire un campione di sangue di circa 150 millilitri. Le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) saranno isolate da questo campione e conservate a -80°C prima dell'uso negli esperimenti proposti. Il DNA genomico sarà anche isolato dal campione per eseguire il sequenziamento HLA.

L'HIT sarà confermato con un test di rilascio funzionale della serotonina e la probabilità di HIT basata sul decorso clinico. Verranno raccolti dati dettagliati riguardanti l'ospedalizzazione del partecipante, la dose e la durata dell'eparina, la conta piastrinica, la storia chirurgica e le comorbilità. Dopo il consenso dei partecipanti, verrà acquisito un campione di sangue periferico, cellule T CD positive ordinate mediante citometria a flusso e DNA genomico isolato come descritto in precedenza.

Il repertorio TCR e la proporzione di varianti TCR specifiche per un particolare campione saranno determinati utilizzando una combinazione di nuove tecnologie disponibili nel laboratorio del ricercatore e nelle strutture principali VANTAGE. Il repertorio TCR di un campione sarà determinato utilizzando la tecnologia di sequenziamento di nuova generazione. È probabile che venga utilizzato il nuovo kit Adaptive Technologies ImmunoSEQ TCR poiché questo kit è stato ottimizzato per ottenere un profilo quantitativo imparziale di alleli TCR riorganizzati da un campione di DNA genomico. Attualmente questo kit è in fase di beta test e VANTAGE è uno dei siti di test.

Il sequenziamento del TCR verrà eseguito utilizzando un sistema PCR multiplex per amplificare il DNA TCRbeta riarrangiato utilizzando primer specifici per un segmento TCR Vbeta funzionale come descritto in precedenza. I modelli genomici saranno amplificati e l'abbondanza relativa osservata dei clonotipi TCR della famiglia Vbeta 5.1 sarà dedotta dai dati di sequenza utilizzando un algoritmo di massimizzazione delle aspettative. I motivi CDR3 come definiti dal sistema informativo internazionale ImMunoGeneTics (IMGT) saranno previsti sulla base di sequenze di DNA. Per ogni lettura, verrà calcolato il miglior allineamento della sequenza rispetto alle sequenze di riferimento e le letture con punteggi di bassa qualità verranno scartate. Per escludere cellule T non specifiche a causa di impurità di selezione e/o background di stimolazione, saranno trascurati i cloni antigene-specifici con frequenze inferiori all'1%.

Gli alleli TCR noti per essere importanti in specifici DHS saranno presi di mira utilizzando la PCR digitale delle goccioline (ddPCR). Il ddPCR è una nuova tecnologia che fornisce una quantificazione assoluta (la PCR in tempo reale fornisce una quantificazione relativa) del modello target basato su reazioni di PCR con goccioline di emulsione di olio. Il laboratorio del ricercatore ha esperienza con questa nuova tecnologia e le analisi per una serie di importanti alleli TCR sono già state ottimizzate sulla ddPCR nel laboratorio del ricercatore.

Per ridurre al minimo il rischio, verrà raccolto sangue extra per questo studio nello stesso momento in cui vengono prelevati i laboratori di assistenza primaria, ove possibile. Ai partecipanti verrà chiesto di fornire 150 ml di sangue per testare le risposte immunitarie qualitative. I rischi associati alla partecipazione a questo studio si riferiscono a complicanze non comuni della venipuntura e potrebbero includere disagio, lividi, infezioni e/o formazione di coaguli di sangue. I pazienti saranno monitorati per sicurezza e comfort da personale clinico addestrato.

I soggetti saranno monitorati durante il corso dello studio per eventuali eventi avversi. Gli eventi avversi gravi saranno segnalati all'IRB entro 10 giorni dalla notifica dell'evento da parte del PI. Gli eventi avversi non gravi o i casi di non conformità al protocollo verranno segnalati al momento della revisione continua. Il processo sarà monitorato in modo continuo. Non esiste un DSMB né sono previste analisi intermedie.