Immunogenetik der Heparin-induzierten Thrombozytopenie: Ziel 2

Einschlusskriterien: 18 Jahre oder älter; Fähigkeit zur Einwilligung nach Aufklärung; Teilnehmer mit Heparin/PF4-Antikörper- und SRA-Test auf HIT, darunter:

Teilnehmer mit negativen Heparin/PF4-Antikörpern und negativem SRA (Kontrollen), Teilnehmer mit positiven Heparin/PF4-Antikörpern und negativem SRA (Serokonversionsfälle), Teilnehmer mit positiven Heparin/PF4-Antikörpern und positivem SRA (HIT-Fälle); Behandlung mit unfraktioniertem Heparin oder Heparin mit niedrigem Molekulargewicht (Enoxaparin, Dalteparin, Tinzaparin) innerhalb von 7 Tagen nach der Blutentnahme

Ausschlusskriterien: Unter 18 Jahre alt; Unfähigkeit, eine informierte Einwilligung zu erteilen

In dieser Studie findet keine Randomisierung statt. Teilnehmer werden in gleicher Anzahl aus drei Kategorien eingeschrieben: (1) Teilnehmer ohne HIT-Test negativ auf Heparin/PF4-Antikörper (Kontrollen); (2) Teilnehmer ohne HIT, die positiv auf Heparin/PF4-Antikörper getestet wurden (Serokonversionsfälle); (3) Teilnehmer mit HIT, die positiv auf beide Heparin-/PF4-Antikörper getestet wurden (HIT-Fälle).

Die Rekrutierung wird durch Mitarbeiter in der Abteilung für Medizinische Hämatologie und durch wichtiges Studienpersonal im VUMC Clinical Coagulation Laboratory erleichtert. Patienten mit positiven und negativen Heparin/PF4-Antikörper- und Serotonin-Freisetzungstestergebnissen werden im klinischen Koagulationslabor identifiziert und der Anbieter des Patienten wird bezüglich einer möglichen Teilnahme an Forschungsstudien kontaktiert. Wenn der potenzielle Teilnehmer interessiert ist, wird er vom Studienpersonal um eine Studienbeschreibung und eine mögliche Einwilligung gebeten. Alternativ können klinische Mitarbeiter der Abteilung für Hämatologie, die konsultiert werden und direkt an der Patientenversorgung teilnehmen, einen potenziellen Teilnehmer direkt kontaktieren, um seine Bereitschaft zur Teilnahme an der Studie zu erfragen.

Patienten, die der Studie zustimmen, werden gebeten, eine Blutprobe von etwa 150 Millilitern abzugeben. Aus dieser Probe werden mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) isoliert und vor der Verwendung in vorgeschlagenen Experimenten bei -80 °C gelagert. Aus der Probe wird auch genomische DNA isoliert, um eine HLA-Sequenzierung durchzuführen.

Eine HIT wird durch einen funktionellen Serotoninfreisetzungstest und die HIT-Wahrscheinlichkeit basierend auf dem klinischen Verlauf bestätigt. Es werden detaillierte Daten zum Krankenhausaufenthalt des Teilnehmers, zur Heparin-Dosis und -Dauer, zur Thrombozytenzahl, zur chirurgischen Vorgeschichte und zu Komorbiditäten erhoben. Nach Zustimmung der Teilnehmer wird eine periphere Blutprobe entnommen, CD-positive T-Zellen mittels Durchflusszytometrie sortiert und genomische DNA wie zuvor beschrieben isoliert.

Das TCR-Repertoire und der Anteil spezifischer TCR-Varianten für eine bestimmte Probe werden mithilfe einer Kombination neuartiger Technologien bestimmt, die im Labor des Forschers und in den VANTAGE-Kerneinrichtungen verfügbar sind. Das TCR-Repertoire einer Probe wird mithilfe der Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation bestimmt. Wahrscheinlich wird das neue Adaptive Technologies ImmunoSEQ TCR-Kit verwendet, da dieses Kit optimiert wurde, um ein unvoreingenommenes quantitatives Profil neu angeordneter TCR-Allele aus einer genomischen DNA-Probe zu erhalten. Derzeit befindet sich dieses Kit in der Beta-Testphase und VANTAGE ist einer der Teststandorte.

Die TCR-Sequenzierung wird mithilfe eines Multiplex-PCR-Systems durchgeführt, um neu angeordnete TCRbeta-DNA unter Verwendung von Primern zu amplifizieren, die für ein funktionelles TCR-Vbeta-Segment spezifisch sind, wie zuvor beschrieben. Genomische Vorlagen werden amplifiziert und die beobachtete relative Häufigkeit von TCR-Klontypen der Vbeta 5.1-Familie wird aus Sequenzdaten mithilfe eines Erwartungsmaximierungsalgorithmus abgeleitet. CDR3-Motive gemäß der Definition des internationalen ImMunoGeneTics-Informationssystems (IMGT) werden anhand von DNA-Sequenzen vorhergesagt. Für jeden Lesevorgang wird die beste Sequenzausrichtung gegenüber Referenzsequenzen berechnet und Lesevorgänge mit niedrigen Qualitätswerten werden verworfen. Um unspezifische T-Zellen aufgrund von Sortierverunreinigungen und/oder Stimulationshintergrund auszuschließen, werden antigenspezifische Klone mit Häufigkeiten unter 1 Prozent vernachlässigt.

TCR-Allele, von denen bekannt ist, dass sie für bestimmte DHS wichtig sind, werden mithilfe der digitalen Tröpfchen-PCR (ddPCR) gezielt untersucht. Die ddPCR ist eine neue Technologie, die eine absolute Quantifizierung (Echtzeit-PCR bietet eine relative Quantifizierung) der Zielvorlage auf der Grundlage von Öl-Emulsionströpfchen-PCR-Reaktionen ermöglicht. Das Labor des Prüfers hat Erfahrung mit dieser neuen Technologie und Tests für eine Reihe wichtiger TCR-Allele wurden bereits auf der ddPCR im Labor des Prüfers optimiert.

Um das Risiko zu minimieren, wird für diese Studie, wann immer möglich, gleichzeitig mit der Entnahme von Laboren für die Grundversorgung zusätzliches Blut entnommen. Die Teilnehmer werden gebeten, 150 ml Blut abzugeben, um qualitative Immunantworten zu testen. Die mit der Teilnahme an dieser Studie verbundenen Risiken beziehen sich auf seltene Komplikationen bei der Venenpunktion und können Beschwerden, Blutergüsse, Infektionen und/oder die Bildung von Blutgerinnseln umfassen. Die Patienten werden von geschultem klinischem Personal auf Sicherheit und Komfort überwacht.

Die Probanden werden im Verlauf der Studie auf etwaige unerwünschte Ereignisse überwacht. Schwerwiegende unerwünschte Ereignisse werden dem IRB innerhalb von 10 Tagen nach Benachrichtigung des PI über das Ereignis gemeldet. Nicht schwerwiegende unerwünschte Ereignisse oder Fälle der Nichteinhaltung des Protokolls werden zum Zeitpunkt der fortlaufenden Überprüfung gemeldet. Der Prozess wird fortlaufend überwacht. Es gibt weder ein DSMB, noch sind Zwischenanalysen geplant.