Imunogenética da Trombocitopenia Induzida por Heparina: Objetivo 2

Critérios de inclusão: idade igual ou superior a 18 anos; Capacidade de dar consentimento informado; Participantes com teste de anticorpo heparina/PF4 e SRA para HIT, incluindo:

participantes com anticorpos heparina/PF4 negativos e SRA negativos (controles), participantes com anticorpos heparina/PF4 positivos e SRA negativos (casos de soroconversão), participantes com anticorpos heparina/PF4 positivos e SRA positivos (casos HIT); Tratamento com heparina não fracionada ou heparina de baixo peso molecular (enoxaparina, dalteparina, tinzaparina) dentro de 7 dias após a coleta de sangue

Critérios de Exclusão: Menor de 18 anos; Incapacidade de dar consentimento informado

Não há randomização envolvida neste estudo. Os participantes serão inscritos em números iguais de três categorias: (1) participantes sem HIT com teste negativo para heparina/anticorpos PF4 (controles); (2) participantes sem teste de HIT positivo para anticorpos heparina/PF4 (casos de soroconversão); (3) participantes com teste de HIT positivo para ambos os anticorpos heparina/PF4 (casos de HIT).

O recrutamento será facilitado por colaboradores do Departamento de Hematologia Médica e por funcionários-chave do estudo no Laboratório de Coagulação Clínica do VUMC. Os pacientes com resultados positivos e negativos do anticorpo heparina/PF4 e do ensaio de liberação de serotonina serão identificados no Laboratório de Coagulação Clínica e o provedor do paciente será abordado sobre a possível participação em estudos de pesquisa. Se o potencial participante estiver interessado, ele será abordado pela equipe do estudo para descrição do estudo e possível consentimento. Alternativamente, os colaboradores clínicos da Divisão de Hematologia que são consultados e participam diretamente no atendimento de um paciente podem entrar em contato diretamente com um potencial participante para se dispor a participar do estudo.

Os pacientes que consentirem no estudo serão solicitados a fornecer uma amostra de sangue de aproximadamente 150 mililitros. Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) serão isoladas desta amostra e armazenadas a -80C antes de serem utilizadas nos experimentos propostos. O DNA genômico também será isolado da amostra para realizar o sequenciamento do HLA.

O HIT será confirmado com um ensaio funcional de liberação de serotonina e a probabilidade de HIT com base no curso clínico. Dados detalhados serão coletados sobre a hospitalização do participante, dose e duração da heparina, contagem de plaquetas, histórico cirúrgico e comorbidades. Após o consentimento dos participantes, uma amostra de sangue periférico será coletada, as células T CD positivas serão separadas por citometria de fluxo e o DNA genômico isolado conforme descrito anteriormente.

O repertório de TCR e a proporção de variantes específicas de TCR para uma determinada amostra serão determinados usando uma combinação de novas tecnologias disponíveis no laboratório do investigador e nas instalações principais do VANTAGE. O repertório TCR de uma amostra será determinado usando tecnologia de sequenciamento de última geração. É provável que o novo kit Adaptive Technologies ImmunoSEQ TCR seja utilizado, pois foi otimizado para obter um perfil quantitativo imparcial de alelos TCR rearranjados de uma amostra de DNA genômico. Atualmente este kit está em fase beta de teste e a VANTAGE é um dos locais de teste.

O sequenciamento do TCR será realizado usando o sistema de PCR multiplex para amplificar o DNA TCRbeta rearranjado usando primers específicos para um segmento TCR Vbeta funcional conforme descrito anteriormente. Modelos genômicos serão amplificados e a abundância relativa observada de clonótipos de TCR da família Vbeta 5.1 será inferida a partir de dados de sequência usando um algoritmo de maximização de expectativa. Os motivos CDR3 definidos pelo sistema internacional de informação ImMunoGeneTics (IMGT) serão previstos com base nas sequências de DNA. Para cada leitura, o melhor alinhamento de sequência em relação às sequências de referência será calculado e as leituras com pontuações de baixa qualidade serão descartadas. Para excluir células T inespecíficas devido à triagem de impurezas e/ou fundo de estimulação, clones específicos de antígeno com frequências abaixo de 1 por cento serão negligenciados.

Os alelos TCR conhecidos por serem importantes em DHS específicos serão direcionados usando PCR digital de gotículas (ddPCR). O ddPCR é uma nova tecnologia que fornece quantificação absoluta (PCR em tempo real fornece quantificação relativa) do modelo alvo com base em reações de PCR de gotículas de emulsão de óleo. O laboratório do investigador tem experiência com esta nova tecnologia e ensaios para vários alelos TCR importantes já foram otimizados no ddPCR no laboratório do investigador.

Para minimizar o risco, sangue extra será coletado para este estudo ao mesmo tempo em que os laboratórios de cuidados primários são coletados, sempre que possível. Os participantes serão solicitados a fornecer 150ml de sangue para testar as respostas imunológicas qualitativas. Os riscos associados à participação neste estudo estão relacionados a complicações incomuns de punção venosa e podem incluir desconforto, hematomas, infecção e/ou formação de coágulos sanguíneos. Os pacientes serão monitorados para segurança e conforto por pessoal clínico treinado.

Os indivíduos serão monitorados durante o curso do estudo para quaisquer eventos adversos. Eventos adversos graves serão relatados ao IRB em até 10 dias após a notificação do evento pelo PI. Eventos adversos não graves ou casos de não conformidade com o protocolo serão relatados no momento da revisão contínua. O julgamento será monitorado de forma contínua. Não há DSMB nem nenhuma análise provisória planejada.