Skuteczność leczenia dużymi dawkami albumin w poprawie przeżycia bez przeszczepu wątroby u pacjentów z ostrą dekompensacją marskości wątroby

Metodologia

DAWKOWANIE Do tego prospektywnego badania kohortowego włączeni zostaną kolejni pacjenci z marskością wątroby, spełniający kryteria włączenia i wykluczenia. Szczegóły dotyczące obliczania liczebności próby podano w rozdziale dotyczącym metod statystycznych. Nasilenie choroby wątroby zostanie ocenione zgodnie z oceną ciężkości - CTP i MELD.

Pacjenci zostaną włączeni do badania i będą otrzymywać albuminę w wysokiej dawce 25% w dawce 1,5 g/kg/tydzień przez 12 tygodni, a następnie będą obserwowani pod kątem rozwoju powikłań wątrobowych, konieczności hospitalizacji i paracentezy. Zbadany zostanie wpływ terapii albuminami na układową hemodynamikę, czynność serca, ogólnoustrojowe zapalenie, infekcje bakteryjne oraz funkcję śródbłonka i krzepnięcie. Pacjenci otrzymywaliby standardowe leczenie zgodnie z protokołem instytucji.

Ważne definicje:

Ostra dekompensacja marskości zostanie zdefiniowana zgodnie z kryteriami APASL. Dzieje się tak w marskości wątroby z lub bez wcześniejszej dekompensacji i często wiąże się z wytrącaniem. Choroba Alzheimera ma postać wątrobową (żółtaczka, wodobrzusze, HE) lub pozawątrobową (krwawienie z żylaków, ostra niewydolność nerek lub posocznica), a okres do 3 miesięcy.

Zakażenia: należy zdefiniować jako Zapalenie płuc: Nowo nabyte objawy ze strony układu oddechowego (kaszel, odkrztuszanie i/lub duszność) oraz zdjęcie rentgenowskie klatki piersiowej wykazujące nacieki w płucach [2] Bakteriemia samoistna: Dodatnie posiewy krwi bez przyczyny bakteriemii [2] Zakażenie dróg moczowych: Ponad 10 leukocytów na pole o dużej mocy w moczu i dodatnie posiewy moczu [3] Spontaniczne bakteryjne zapalenie otrzewnej: Rozpoznano w obecności tak liczba granulocytów obojętnochłonnych w płynie cytowym >250 mm3 [7] Encefalopatia wątrobowa: została zdefiniowana zgodnie z kryteriami West-Haven [5] Ostre krwawienie z żylaków: została zdiagnozowana zgodnie z kryteriami endoskopowymi Baveno V. [6] Wodobrzusze oporne/nawracające: zgodnie z kryteriami EASL [8] Zaburzenia krążenia wywołane paracentezą: PICD zdefiniowano jako 50% wzrost PRA w stosunku do wartości wyjściowych w dniu 6. [9] Ostre uszkodzenie nerek: zostanie zdefiniowane zgodnie z kryteriami IAC. [10] Rekompensacja: zdefiniowana jako pacjenci z dekompensacją (poprzedni epizod wodobrzusza), którzy byli klinicznie niewidoczni bez wodobrzusza lub z kontrolowanym wodobrzuszem stosującym leczenie medyczne w momencie włączenia. [11]

Badania: Wyjściowa HVPG z oceną funkcji wrotnej (hemodynamika ogólnoustrojowa i płucna) oraz funkcji skurczowej i rozkurczowej rezerwy serca (2D-ECHO i echokardiografia obciążeniowa), cystatyna C, NGAL i KIM-1 w moczu, zwykły CT, biomarkery sercowe (NT-Pro BNP, troponina I), izoformy albumin, macierz cytokin, poziomy endotoksyn. Markery funkcji śródbłonka (ADAMTS, vWF) i krzepnięcia (tromboelastometria rotacyjna EXTEM) Zwykła tomografia komputerowa do oceny sarkopenii, analiza składu ciała. Masa ciała, ciśnienie krwi i echokardiogram wysiłkowy (jeśli to możliwe) zostaną wykonane u wszystkich pacjentów. Współczynnik przesączania kłębuszkowego (GFR) zostanie oszacowany za pomocą równań eGFR - modyfikacja diety w chorobie nerek (MDRD6) i cystatyna C na podstawie (współpraca z epidemiologią przewlekłej choroby nerek). Wraz z tym zostanie pobrana próbka krwi tętniczej po całonocnej głodówce i leżeniu w łóżku przez co najmniej 8 godzin w pozycji leżącej na aktywność reniny w osoczu, stężenie aldosteronu w osoczu i norepinefryny w osoczu. Pacjenci byli następnie poddawani HVPG, cystatynie C, funkcji serca, biomarkerom sercowym (NT-Pro BNP i troponina I), profilowi ​​cytokin, izoformom albumin po 3 i 6 miesiącach. Powtórzenie zwykłego skanu CT w celu oceny sarkopenii byłoby wykonane po 3 miesiącach i po 6 miesiącach. Obserwacja trwałaby 1 rok lub do TIPS lub przeszczepu wątroby.

Ocena czynności serca: Można to ocenić jako dysfunkcję skurczową lub rozkurczową. Dysfunkcję skurczową definiuje się jako stępiony wzrost pojemności minutowej serca podczas wysiłku fizycznego, prowokacji objętościowej lub bodźców farmakologicznych lub spoczynkowej frakcji wyrzutowej <55%.

Dysfunkcja rozkurczowa zostanie zdefiniowana na podstawie stosunku wczesnych do późnych (przedsionkowych) faz napełniania komór lub stosunku E/A <1,0 (z uwzględnieniem wieku), przedłużonego czasu deceleracji (>200 ms) lub przedłużonego czasu relaksacji izowolumetrycznej (>80 ms). infuzja (40 µg/kg/min). Nieprawidłowa odpowiedź zostanie zdefiniowana jako zmniejszenie objętości końcoworozkurczowej lewej komory o mniej niż 10%, zmniejszenie objętości końcowoskurczowej o mniej niż 20% i zwiększenie frakcji wyrzutowej lewej komory (EF) o mniej niż 10% podczas szczytowego wlewu dobutaminy. )]×100} .Niekompetencja chronotropowa zostanie zdefiniowana jako HRR poniżej 80%.

Dysfunkcja rozkurczowa występuje, gdy mięsień sercowy lewej komory nie poddaje się i nie jest w stanie przyjąć krwi powracającej w normalny sposób z lewego przedsionka. Istnieją cztery stopnie dysfunkcji rozkurczowej, jak opisano poniżej. Echokardiografia jest złotym standardem w diagnostyce dysfunkcji rozkurczowej.

Dysfunkcja rozkurczowa stopnia I: Jest to normalne odkrycie i występuje u prawie 100% osób w wieku 60 lat. Prędkość fali E jest zmniejszona, co powoduje odwrócenie E/A (stosunek < 1,0). Ciśnienie w lewym przedsionku jest prawidłowe. Czas hamowania fali E jest wydłużony i wynosi > 200 ms. Stosunek e/e' mierzony tkankowym Dopplerem jest prawidłowy.

Dysfunkcja rozkurczowa stopnia II: jest patologiczna i powoduje podwyższone ciśnienie w lewym przedsionku. Stosunek E/A jest prawidłowy (0,8 ± 1,5), czas hamowania jest prawidłowy (160-200 ms), natomiast stosunek e/e' jest podwyższony. Stosunek E/A będzie < 1 z Valsalvą. Główną wskazówką dotyczącą obecności dysfunkcji rozkurczowej stopnia II w porównaniu z prawidłową funkcją rozkurczową jest obecność strukturalnych chorób serca, takich jak powiększenie lewego przedsionka, przerost lewej komory lub dysfunkcja skurczowa.

Dysfunkcja rozkurczowa stopnia III: Powoduje to znacznie podwyższone ciśnienie w lewym przedsionku. Znany również jako „restrykcyjny wzorzec napełniania”, stosunek E/A wynosi > 2,0, czas zwalniania wynosi < 160 ms, a stosunek e/e' jest podwyższony.

Dysfunkcja rozkurczowa stopnia IV: Wskazuje to na złe rokowanie i bardzo podwyższone ciśnienie w lewym przedsionku. Stosunek E/A jest > 2,0, czas zwalniania jest niski, a stosunek e/e' jest podwyższony. Jest to rzadko spotykane w marskości wątroby.

Ocena immunologiczna związana z albuminami:

Uznanie immunomodulacji za ważny mechanizm działania albumin. Dodatkowe eksperymenty zostałyby przeprowadzone na początku badania, po 3 i 6 miesiącach w celu oceny izoform albuminy (HMA, HNA1, HNA2, IMA), poziomów cytokin prozapalnych i przeciwzapalnych (macierz cytokin na bazie multipleksu luminex), mediatorów stanu zapalnego (białko C-reaktywne, test endotoksyny, białka dopełniacza; DAMPS); Frekwencja i profil czynnościowy komórek odporności wrodzonej (monocyty, neutrofile)

Analiza izoform albuminy:

Chemikalia Zmiana izoformy albuminy zostanie przeprowadzona poprzez oznaczenie ilościowe różnych modyfikacji albuminy (HMA, HNA1, HNA2, IMA) na spektrometrze mas orbitrap z jonizacją w rozpylaniu elektronów (Q Exative plus) sprzężonym z UHPLC firmy Thermoscientific USA. W skrócie wyizolowane osocze krwi pacjentów w danym punkcie czasowym (dzień 0 i trzy miesiące) zostanie rozcieńczone wodą destylowaną w stosunku 1:4000, a następnie 8 ul tej rozcieńczonej plazmy zostanie wstrzyknięta do systemu MS do wysokosprawnej chromatografii cieczowej z jonizacją przez rozpylanie elektronów. Rozdział metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej zostanie przeprowadzony na kolumnie C8 z odwróconą fazą (Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C8, 2,1 mm id 3 50 mm, 1,8 lm gwintowana kolumna o wielkości porów 300 Å) przy szybkości przepływu 0,2 ml/minutę przy użyciu układu rozpuszczalników H2O-acetonitryl (z 0,1% kwasem mrówkowym) pod gradientem 90%. H2O do 90% acetonitrylu przez okres 25 minut z akwizycją rozpoczynającą się po 3 minutach. W warunkach auto-MS zostanie przeprowadzona analiza widm masowych. Podobna analiza zostanie również przeprowadzona z roztworem egzogennej albuminy. Otrzymane widma MS złożonej jonizacji przez rozpylanie elektronów będą analizowane przy użyciu oprogramowania Protein Deconvolution soft warre (termo-naukowe Niemcy). Tutaj, po zminimalizowaniu chromatogramu piku podstawowego z chromatogramu jonów całkowitych, zostaną uzyskane i przeanalizowane chromatogramy masowe albuminy. Otrzymane widma albumin będą następnie dekonwoluowane w zakresie mas od 66 000 do 67 000 Da (ponieważ masa cząsteczkowa [MW] różnych izoform albumin mieści się w tym zakresie. Wreszcie, na podstawie intensywności pików, zmierzona zostanie obfitość izoform albuminy, a względna obfitość różnych izoform HSA zostanie podana, jak opisano w Das i in. 2017. Zostanie to przeprowadzone na początku badania i po 3 miesiącach. ( Woda do spektrometrii mas (MS), acetonitryl i kwas mrówkowy zostaną zakupione od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Oczyszczoną HSA zakupiono od firmy Baxter (Gurgaon, Indie). Wszystkie odczynniki będą miały stopień analityczny.

Macierz cytokin Panel 45 cytokin, chemokin i czynników wzrostu będzie analizowany w osoczu krwi grupy pacjentów na początku badania i po 3 miesiącach przy użyciu systemu oznaczania kulek cytokinowych Bio-Plex multiplex (Bio-Rad, CA) zgodnie z protokołem producenta. Współczynnik zmienności wewnątrz testu i między testami brany pod uwagę dla testów multipleksowych będzie < 5%

Profilowanie komórek odporności wrodzonej:

Całkowita krew pełna zostanie pobrana od pacjentów przed i po terapii i oceniona pod kątem procentowej częstości monocytów przez barwienie znakowanymi fluorochromem anty-CD14, anty-CD16 i dla neutrofilów, anty-CD11b, anty-CD16, anty-CD15, anty-CD66b i zostanie pobrana i przeanalizowana przy użyciu cytometrii przepływowej FACS verse (BD Biosciences). W celu profilowania funkcjonalnego komórek odporności wrodzonej krew zostanie podzielona na dwie części. PBMC zostaną wyizolowane przy użyciu ficoll-hypaque (Himedia), a monocyty zostaną wyizolowane przy użyciu zestawu do izolacji CD14 firmy miltenyi biotech, zgodnie z protokołem wytwarzania. Podczas gdy inna część krwi zostanie wykorzystana do wyizolowania neutrofilów przy użyciu gran-hypaque (Himedia). Wewnątrzkomórkowe cytokiny takie jak IFN-y, TNF-a, IL-1b będą analizowane po niskiej dawce stymulacji LPS. Również wybuch fagocytarny lub generowanie ROS zostanie przeprowadzone przy użyciu protokołu opisanego przez producenta. Ponownie dane zostaną pozyskane i przeanalizowane przy użyciu wersetu FACS (BD Biosciences).

Metodologia analizy metabolicznej konika morskiego:

Wpływ na metabolizm energetyczny monocytów (które kierują właściwościami funkcjonalnymi komórek odpornościowych) analizujemy, mierząc współczynnik zakwaszenia pozakomórkowego (ECAR) i wskaźnik zużycia tlenu (OCR) za pomocą analizatora strumienia pozakomórkowego Seahorse XF24 w monocytach krwi obwodowej pacjentów na początku badania i po 3 miesiącach jako miarę produkcji mleczanu (zastępczej dla szybkości glikolizy) i odpowiednio OXPHOS. W skrócie, monocyty zostaną wyizolowane ze świeżo pobranej krwi przy użyciu zestawu do izolacji CD14 firmy miltenyi biotech, zgodnie z protokołem produkcji. Izolowane monocyty zostaną wysiane w trzech powtórzeniach przy gęstości 1 x 105 komórek na studzienkę. Przed rozpoczęciem testu komórki będą inkubowane w pożywce Seahorse Assay Medium uzupełnionej 10 mM glukozą i 1 mM pirogronianu sodu i glutaminą w inkubatorze w 37°C bez CO2 przez 45 min. Dalsza zmiana parametrów fosforylacji oksydacyjnej zostanie obliczona na podstawie zmiany OCR w czasie rzeczywistym w odpowiedzi na leczenie oligomycyną (inhibitor ATPazy, 1 μM), FCCP (0,2 μM) i rotenonem (0,5 μM).

Populacja badana: Pacjenci z ostrą dekompensacją marskości wątroby

Projekt badania:

• Prospektywne badanie obserwacyjne
• Badanie zostanie przeprowadzone na pacjentach przyjętych do Kliniki Hepatologii w latach 2021-2022
• Grupę badaną stanowić będą pacjenci z ostrą dekompensacją marskości wątroby

Obliczenie wielkości próby: Biorąc pod uwagę korzyść w zakresie przeżycia po podaniu albuminy jako 60% w porównaniu do 35% przy standardowym leczeniu, oszacowana wielkość próby dla porównania jednej próbki z wartością hipotetyczną

Test Ho: p = 0,3500, gdzie p jest odsetkiem w populacji

Założenia:

alfa = 0,0500 (dwustronnie) potęga = 0,9500 alternatywa p = 0,6000

Ponadto, zakładając spadek o 20%.

Szacunkowa wymagana wielkość próbki:

n = 55 Oszacowaliśmy minimalną wielkość próby do badania na 55 pacjentów.

Interwencja: Wysoka dawka 25% albuminy 1,5 g/kg/tydzień co tydzień przez 12 tygodni

Monitorowanie i ocena: Kontynuacja: co tydzień przez 1 miesiąc, 2 miesiące i 3 miesiące

Analiza statystyczna

• Wszystkie zmienne wyraża się jako średnią (sd) lub medianę (zakres)
• Zmienne zostaną porównane testem U Manna-Whitneya
• Dla zmiennych kategorialnych użyjemy testu Chi-Square lub Fishera
• Analiza przeżycia zostanie przeprowadzona przy użyciu analizy regresji proporcjonalnej Coxa
• Aktuarialne prawdopodobieństwo przeżycia oblicza się za pomocą wykresu Kaplana-Meiera i porównuje za pomocą testu log-rank.
• Zostanie przeprowadzona analiza przeżycia konkurencyjnego ryzyka z konkurencyjnymi zdarzeniami, takimi jak TIPS i przeszczep wątroby