减肥手术的微生物学

假设 研究人员假设肠道微生物失调和多样性下降导致肥胖的发展和长期存在。 生态失调的影响是多方面的，包括肠道屏障功能下降以及由此引发的局部和全身炎症，从而引发代谢综合征。 RYGB 和 SG 后肠道生理学的改变将导致特定微生物种群的可识别变化和多样性的增加。 特定的有益微生物变化将随后导致体重减轻、炎症减少和代谢特征正常化。

方法 研究人群：将从皇家亚历山德拉医院的埃德蒙顿成人专业减肥诊所招募患者。

样本量：每组 RYGB、SG 和非手术饮食控制组将有 30 名患者（总计 n = 90）。 以前的研究每组包括 15 名或更少的参与者。

样本量计算：样本量计算旨在确保研究能够充分捕捉手术引起的微生物变化。 在先前的文献中，一种重要的产生短链脂肪酸的细菌物种 (F. prausnitzii) 相对丰度在 RYGB 后组低于非手术对照组 (0.031 v. 0.053 σ 0.024)。 如果 alpha 为 0.05，Beta 为 0.90，则每组需要 26 个受试者。 包括 10% 的辍学率，这增加到每组 30 个受试者。

研究设计：对于干预组，受试者将在他们计划进行手术的时间入组。 手术前 2-6 周，将在诊所收集粪便、尿液和血液样本。 在术后期间，粪便收集将在预定的三个月和九个月的门诊就诊时进行。 所有术前样本将在受试者开始 2-4 周的术前液体之前收集，该液体旨在减少肝肿大并简化手术的技术手术方面。

非手术对照将是接受饮食和行为干预以减轻体重的患者。 这包括饮食和活动调整，不包括代餐或药物干预。 对于这个队列，受试者将在开始减肥干预之前进行初始采样（粪便、尿液、血液）。 然后将在干预开始后的三个月和九个月进行进一步的抽样。

样本处理和免疫分析将在阿尔伯塔大学的胃肠道炎症和免疫研究卓越中心 (CEGIIR) 进行。 测序将由 CEGIIR 内的应用基因组学中心进行，代谢组学将在阿尔伯塔大学的代谢组学创新中心进行，并收取服务费。

粪便微生物分析：粪便样本收集将由我们小组用于炎症性肠病饮食研究的先前开发方案驱动。 将向患者提供收集杯，并指示他们在预约前一天晚上或早上收集标本。 受试者将被指示在此期间将标本储存在冰箱中。 将分析粪便样本的微生物组成、炎症信号和粪便钙卫蛋白。

将使用 16S rRNA 基因分析评估粪便样本的微生物群落组成。 使用 QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen，Valencia，CA，USA）结合酶促和机械细胞裂解，从粪便匀浆中提取 DNA。 粪便微生物群组成将通过使用 MiSeq Illumina 技术（配对末端）的 16S rRNA 标签测序来表征，靶向 V3-V5 区域。 质量控制的读数将使用 1) 基于分类学的方法进行分析，例如序列分类法全球对齐 (GAST)15 和核糖体数据库项目多分类器工具和 2) 非基于分类学的聚类算法，用于使用 UPARSE 确定操作分类单元管道。 Alpha 多样性（观察物种、Shannon、Simpson）和 β 多样性指数（Bray-Curtis、binary Jaccard）将在 QIIME 和 R（VEGAN 包）中计算。 β-多样性指标的排序图将通过 R 中的非参数多维缩放排序生成。为了评估微生物组的功能组成，将使用 PICRUSt 算法推断微生物群落的基因含量16。 PICRUSt 使用 IMG（整合微生物基因组）数据库中有关基因含量和 16S rRNA 基因拷贝数的信息来预测实验样本的生物体中存在哪些基因。 使用 QIIME/UPARSE 生成的 OTU 表将通过 16S rRNA 基因拷贝数进行归一化，并且在使用 PICRUSt 执行的基因内容推断过程中，将此类归一化值乘以每个分类单元中基因家族的计算丰度。 结果是一个基因家族计数表，可与宏基因组注释流程（如 HUMAnN 和 MG-RAST）生成的基因家族计数表相媲美，并且可以组织成代谢途径。 最后，将量化每个 OTU 对给定基因功能的贡献。 为了识别不同群体中具有不同丰度的微生物种群和代谢途径，LDA（线性判别分析）效应量（LEfSe）算法将与在线界面 Galaxy（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy /根）。

尿液和血清代谢组学：将在受试者就诊期间收集尿液和血液样本。 将在含有叠氮化钠以防止细菌生长的标准尿液收集罐中获取尿液样本，并在收集后冷冻。 血液样本将在常规临床指示血液检查时收集在肝素化收集管中，特别是术前六周以及术后三和九个月。 收集后以 2 000 g 离心 10 分钟分离血清，并在 -80⁰C 下储存。 尿液和血清样本将用于在每个时间点使用 NMR 光谱进行代谢组学分析。

代谢组学分析将通过阿尔伯塔大学的代谢组学创新中心使用 NMR 光谱学完成。 样品将在 4 通道 Varian INOVA 600 MHz NMR 光谱仪上运行。 将遵循标准的 Chenomx 采集和处理参数。 使用 Chenomx NMR Suite 软件的 1 H-NMR 分析将允许同时鉴定多达 300 个小分子。 所得 NMR 光谱将使用靶向分析技术进行分析，将光谱与已知参考数据库进行比较以识别代谢物。

炎症细胞因子和趋化因子：将评估血清以测量促红细胞生成素沉降率 (ESR) 和 C 反应蛋白 (CRP) 作为全身炎症的测量值，以及 LPS 作为细菌移位的测量值。

将分析血清和组织样本的炎性细胞因子和趋化因子。 组织样本将在手术时由研究小组的一名成员收集。 SG 患者从胃部采集粘膜标本，RYGB 患者从胃部和空肠采集粘膜标本，在手术室使用液氮快速冷冻，随后在 -80⁰C 下保存。 这些样本作为程序的标准部分被移除。 将对它们进行炎性细胞因子分析。 在之前的研究中，研究人员与我们城市周围的手术室工作人员和外科医生建立了良好的工作关系，这将促进这一过程。

将使用 Meso Scale Discovery 平台（MSD，Gaithersburg，美国马里兰州）通过细胞因子和趋化因子的蛋白质表达来评估样品中的宿主免疫反应。 使用这种多阵列技术将为我们提供动态范围和灵敏度，以便在单个样本中同时测量大量炎症和稳态信号。 考虑到减肥手术、体重减轻和胆汁酸之间的明显关系，研究人员最初将关注参与法尼醇 X 受体通路的细胞因子 17。 具体而言，这些细胞因子包括 IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、TNFα 和 MCP-1。

分析：系统生物学方法将用于结合宏基因组学、代谢组学和多重免疫分析，以确定减肥手术后发生的组合微生物、代谢和免疫学变化。 连续变量和结果之间的差异将通过 Wilcoxon 秩和检验进行评估。 分类解释变量与结果之间的差异将通过卡方检验或当单元格大小 <5 时的 Fisher 精确检验来评估。 通过单变量逻辑回归的似然比检验在 p < 0.10 水平上显着的变量将被输入到多变量逻辑回归中。 将使用向后逐步选择程序，并且将在多变量模型中保留那些似然比 p 值 <0.05 的变量。 QIIME（微生物生态学定量洞察）、MEGAN（MEtaGenome 分析仪）和 Metastats 将使用 CEGIIR 开发的专业知识并与系统生物学专家 Gane Wong 博士合作进行。

局限性

• 减肥手术的变化对一般减肥的适用性
• 区分变化的因果关系
• 评估手术前后饮食变化的影响