De microbiologie van bariatrische chirurgie

HYPOTHESE De onderzoekers veronderstellen dat intestinale microbiële dysbiose en een afname van de diversiteit bijdragen aan het ontstaan ​​en in stand houden van obesitas. Het effect van dysbiose is multifactorieel en omvat een afname van de darmbarrièrefunctie en resulterende lokale en systemische ontsteking die het metabool syndroom veroorzaakt. De veranderde darmfysiologie na RYGB en SG zal leiden tot identificeerbare veranderingen in specifieke microbiële populaties en een toename van de diversiteit. Specifieke gunstige microbiële veranderingen zullen vervolgens resulteren in gewichtsverlies, verminderde ontsteking en een genormaliseerd metabolisch profiel.

METHODEN Studiepopulatie: Patiënten zullen worden gerekruteerd uit de Edmonton Adult Specialty Bariatric Clinic in het Royal Alexandra Hospital.

Steekproefomvang: elk cohort van RYGB, SG en niet-chirurgische dieetcontroles zal 30 patiënten hebben (totaal n = 90). Eerdere studies omvatten 15 of minder deelnemers per arm.

Berekening van de steekproefomvang: De berekening van de steekproefomvang was ontworpen om ervoor te zorgen dat het onderzoek de door een operatie veroorzaakte microbiële veranderingen adequaat zou vastleggen. In eerdere literatuur werd een belangrijke vetzuurproducerende bacteriesoort met een korte keten (F. prausnitzii) was de relatieve hoeveelheid lager in een post-RYGB-groep in vergelijking met niet-operatieve controles (0,031 v. 0,053 σ 0,024). Met een alfa van 0,05 en een bèta van 0,90 zouden hiervoor 26 proefpersonen per arm nodig zijn. Inclusief een uitval van 10% loopt dit op tot 30 proefpersonen per arm.

Studieopzet: Voor de interventie-arm zullen proefpersonen worden ingeschreven op het moment dat ze gepland staan ​​voor een operatie. Feces-, urine- en bloedmonsters worden 2-6 weken voorafgaand aan de operatie in de kliniek verzameld. In de postoperatieve periode vindt fecale verzameling plaats tijdens geplande kliniekbezoeken van drie en negen maanden. Alle pre-operatieve monsters zullen worden verzameld voordat de proefpersonen een pre-operatieve vloeistof van 2-4 weken starten die is ontworpen om hepatomegalie te verminderen en de technische chirurgische aspecten van de procedure te vergemakkelijken.

Niet-chirurgische controles zijn patiënten die worden behandeld met dieet- en gedragsinterventies voor gewichtsverlies. Dit omvat dieet- en activiteitsaanpassingen en sluit maaltijdvervanging of farmacologische interventies uit. Voor dit cohort zullen proefpersonen een eerste bemonstering (fecaal, urine, bloed) laten nemen voorafgaand aan het starten van interventies voor gewichtsverlies. Verdere bemonstering vindt dan plaats drie en negen maanden na aanvang van de interventie.

Monsterverwerking en immuunanalyse zullen plaatsvinden in het Centre of Excellence for Gastrointestinal Inflammation and Immunity Research (CEGIIR) aan de Universiteit van Alberta. Sequencing zal worden uitgevoerd door het Applied Genomics Centre binnen CEGIIR en metabolomics zal worden gedaan in het Metabolomic Innovation Centre van de Universiteit van Alberta als vergoeding voor service.

Fecale microbiële analyse: Fecale monsterverzameling zal worden aangestuurd door een eerder ontwikkeld protocol dat door onze groep wordt gebruikt voor dieetstudies bij inflammatoire darmaandoeningen. Patiënten krijgen verzamelbekers en ze krijgen de instructie om de avond voorafgaand aan of de ochtend van hun afspraak een monster te verzamelen. Proefpersonen krijgen de instructie om het monster tussentijds in de koelkast te bewaren. Fecale monsters zullen worden geanalyseerd op microbiële samenstelling, ontstekingssignalen en fecaal calprotectine.

De samenstelling van de microbiële gemeenschap van fecale monsters zal worden beoordeeld met behulp van 16S rRNA-genanalyses. DNA zal worden geëxtraheerd uit de fecale homogenaten die enzymatische en mechanische cellysis combineren met de QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, VS). De samenstelling van de fecale microbiota zal worden gekenmerkt door 16S rRNA-tagsequencing met behulp van de MiSeq Illumina-technologie (pair-end), gericht op de V3-V5-regio's. Op kwaliteit gecontroleerde reads zullen worden geanalyseerd met behulp van 1) taxonomische benaderingen zoals Global Alignment for Sequence Taxonomy (GAST)15 en de Ribosomal Database Project MultiClassifier-tool en 2) niet-taxonomische clusteringalgoritmen voor bepaling van operationele taxonomische eenheden met de UPARSE pijpleiding. Alfa-diversiteit (waargenomen soorten, Shannon, Simpson) en β-diversiteitsindices (Bray-Curtis, binaire Jaccard) zullen worden berekend in QIIME en R (VEGAN-pakket). Ordinatieplots voor β-diversiteitsmetrieken zullen worden gegenereerd door niet-parametrische multidimensionale schalingsordening in R. Om de functionele samenstelling van het microbioom te beoordelen, zal het gengehalte van de microbiële gemeenschap worden afgeleid met behulp van het PICRUSt-algoritme16. PICRUSt gebruikt informatie over geninhoud en 16S rRNA-genkopienummer uit de IMG-database (integrated microbiële genomen) om te voorspellen welke genen aanwezig zijn in organismen van de experimentele monsters. OTU-tabellen gegenereerd met QIIME/UPARSE zullen worden genormaliseerd door het 16S rRNA-genkopienummer en dergelijke genormaliseerde waarden worden vermenigvuldigd met de berekende abundantie van genfamilies in elk taxon tijdens de geninhoud-inferentieprocedure die wordt uitgevoerd met PICRUSt. Het resultaat is een tabel met het aantal genenfamilies die vergelijkbaar is met die gegenereerd door metagenoom-annotatiepijplijnen zoals HUMANN en MG-RAST en die kan worden georganiseerd in metabolische routes. Ten slotte zal de bijdrage van elke OTU aan een bepaalde genfunctie worden gekwantificeerd. Om microbiële populaties en metabole routes met differentiërende overvloed in de verschillende groepen te identificeren, zal het LDA (Linear Discriminant Analysis) Effect Size (LEfSe) algoritme worden gebruikt met de online interface Galaxy (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy /wortel).

Urine- en serummetabolomica: Urine- en bloedmonsters worden verzameld tijdens het bezoek aan de kliniek van de proefpersoon. Urinemonsters worden verkregen in een standaard urineverzamelpot die natriumazide bevat om bacteriegroei te voorkomen, en worden na verzameling ingevroren. Bloedmonsters worden verzameld in gehepariniseerde verzamelbuisjes op het moment van routinematig klinisch geïndiceerd bloedonderzoek, met name zes weken vóór de operatie en drie en negen maanden na de operatie. Serum wordt geïsoleerd door centrifugatie bij 2 000 g gedurende 10 minuten na verzameling en bewaard bij -80 ⁰C. Urine- en serummonsters zullen worden gebruikt voor metabolomics-profilering met behulp van NMR-spectroscopie op elk tijdstip.

Metabolomic-profilering zal worden gedaan met NMR-spectroscopie via het Metabolomics Innovation Centre aan de Universiteit van Alberta. Monsters worden uitgevoerd op een 4-kanaals Varian INOVA 600 MHz NMR-spectrometer. Standaard Chenomx-acquisitie- en verwerkingsparameters zullen worden gevolgd. 1H-NMR-analyse met Chenox NMR Suite-software maakt gelijktijdige identificatie van maximaal 300 kleine moleculen mogelijk. De resulterende NMR-spectra zullen worden onderworpen aan analyse met behulp van de techniek van gerichte profilering waarbij spectra worden vergeleken met een bekende referentiedatabase om metabolieten te identificeren.

Inflammatoire cytokines en chemokines: Serum zal worden beoordeeld voor meting van erytropoëtinebezinkingssnelheid (ESR) en C-reactief proteïne (CRP) als metingen van systemische ontsteking, en LPS, als meting van bacteriële translocatie.

Zowel serum- als weefselmonsters zullen worden geanalyseerd op inflammatoire cytokines en chemokines. Weefselmonsters zullen worden verzameld door een lid van het onderzoeksteam op het moment van de operatie. Voor SG-patiënten wordt een mucosaal monster uit de maag genomen en voor RYGB-patiënten uit zowel de maag als het jejunum, in de operatiekamer snel ingevroren met vloeibare stikstof en vervolgens bewaard bij -80⁰C. Deze monsters worden verwijderd als een standaard onderdeel van de procedures. Ze zullen worden geanalyseerd op inflammatoire cytokines. De onderzoekers hebben in eerdere studies een goede werkrelatie opgebouwd met operatiekamerpersoneel en chirurgen in onze steden, wat dit proces zal vergemakkelijken.

De immuunrespons van de gastheer zal worden beoordeeld in monsters door eiwitexpressie van cytokines en chemokines met behulp van het Meso Scale Discovery-platform (MSD, Gaithersburg, Maryland, VS). Het gebruik van deze multi-array-technologie zal ons een dynamisch bereik en de gevoeligheid geven om een ​​groot aantal inflammatoire en homeostatische signalen tegelijkertijd in een enkel monster te meten. De onderzoekers zullen zich in eerste instantie concentreren op cytokine dat betrokken is bij de Farnesoid X-receptorroutes, gezien de schijnbare relatie tussen bariatrische chirurgie, gewichtsverlies en galzuren17. Specifiek omvatten deze cytokinen IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, TNFa en MCP-1.

Analyse: Een systeembiologische benadering zal worden gebruikt om de metagenomica, metabolomica en multiplex immuunprofilering te combineren om de gecombineerde microbiële, metabolische en immunologische veranderingen te definiëren die optreden na bariatrische chirurgie. Verschillen tussen continue variabelen en uitkomst worden beoordeeld met de Wilcoxon rank sum-test. Verschillen tussen categorische verklarende variabelen en de uitkomst worden beoordeeld met de chikwadraattoets, of Fisher's exact-toets wanneer de celgrootte <5 is. Variabelen die significant zijn op het niveau p < 0,10 op basis van de waarschijnlijkheidsratiotest van univariate logistische regressie zullen worden ingevoerd in multivariabele logistische regressie. Een achterwaartse stapsgewijze selectieprocedure zal worden gebruikt en die variabelen met een waarschijnlijkheidsratio p-waarde <0,05 zullen in het multivariabele model worden gehandhaafd. QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology), MEGAN (MEtaGenome Analyzer) en Metastats zullen worden uitgevoerd met behulp van de expertise die is ontwikkeld bij CEGIIR en in samenwerking met Dr. Gane Wong, een systeembiologie-expert.

BEPERKINGEN

• Toepasbaarheid van veranderingen in bariatrische chirurgie op gewichtsverlies in het algemeen
• Onderscheiden oorzaak en gevolg van veranderingen
• Beoordeling van het effect van veranderingen in het voedingspatroon na en voorafgaand aan een operatie