Mikrobiologie bariatrické chirurgie

HYPOTÉZA Výzkumníci předpokládají, že střevní mikrobiální dysbióza a snížení diverzity přispívá k rozvoji a přetrvávání obezity. Účinek dysbiózy je multifaktoriální a zahrnuje snížení střevní bariérové ​​funkce a výsledný lokální a systémový zánět, který podněcuje metabolický syndrom. Změněná střevní fyziologie po RYGB a SG povede k identifikovatelným změnám ve specifických mikrobiálních populacích a ke zvýšení diverzity. Specifické příznivé mikrobiální změny následně povedou ke snížení hmotnosti, snížení zánětu a normalizovanému metabolickému profilu.

METODY Populace studie: Pacienti budou rekrutováni ze speciální bariatrické kliniky pro dospělé v Edmontonu v nemocnici Royal Alexandra.

Velikost vzorku: Každá kohorta RYGB, SG a nechirurgických dietních kontrol bude mít 30 pacientů (celkem n = 90). Předchozí studie zahrnovaly 15 nebo méně účastníků na paži.

Výpočet velikosti vzorku: Výpočet velikosti vzorku byl navržen tak, aby se zajistilo, že studie adekvátně zachytí mikrobiální změny vyvolané chirurgickým zákrokem. V dřívější literatuře byl důležitý bakteriální druh produkující mastné kyseliny s krátkým řetězcem“ (F. prausnitzii) relativní abundance byla nižší ve skupině po RYGB ve srovnání s neoperativními kontrolami (0,031 v. 0,053 σ 0,024). S hodnotou alfa 0,05 a hodnotou beta 0,90 by to vyžadovalo 26 subjektů na rameno. Včetně 10% míry předčasného ukončení se zvyšuje na 30 subjektů na paži.

Návrh studie: Do intervenční větve budou subjekty zařazeny v době, kdy je plánována operace. Vzorky stolice, moči a krve budou odebrány na klinice 2-6 týdnů před operací. V pooperačním období bude odběr stolice probíhat při plánovaných tří a devítiměsíčních návštěvách kliniky. Všechny předoperační vzorky budou odebrány před tím, než subjekty zahájí 2-4týdenní předoperační podávání tekutiny určené ke snížení hepatomegalie a usnadnění technických chirurgických aspektů postupu.

Nechirurgickou kontrolou budou pacienti, kteří jsou léčeni dietními a behaviorálními intervencemi za účelem snížení hmotnosti. To zahrnuje úpravy stravy a aktivity a vylučuje náhradu jídla nebo farmakologické intervence. U této kohorty budou subjektům před zahájením intervencí na snížení hmotnosti odebrány počáteční vzorky (fekály, moč, krev). Další odběr vzorků pak proběhne za tři měsíce a devět měsíců po zahájení zásahu.

Zpracování vzorků a imunitní analýza budou probíhat v Centru excelence pro výzkum zánětu a imunity gastrointestinálního traktu (CEGIIR) na University of Alberta. Sekvenování bude provedeno Centrem aplikované genomiky v rámci CEGIIR a metabolomika bude provedena v Metabolomic Innovation Center na University of Alberta jako poplatek za službu.

Fekální mikrobiální analýza: Sběr vzorků stolice bude založen na dříve vyvinutém protokolu používaném naší skupinou pro dietní studie u zánětlivého onemocnění střev. Odběrové kelímky budou pacientům poskytnuty a budou instruováni, aby odebrali vzorek noc před nebo ráno v den jejich návštěvy. Subjekty budou instruovány, aby mezitím uchovávaly vzorky v lednici. Vzorky stolice budou analyzovány na mikrobiální složení, zánětlivé signály a fekální kalprotektin.

Složení mikrobiální komunity vzorků stolice bude hodnoceno pomocí genových analýz 16S rRNA. DNA bude extrahována z fekálních homogenátů kombinací enzymatické a mechanické lýzy buněk pomocí sady QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Složení fekální mikroflóry bude charakterizováno sekvenováním 16S rRNA tagu pomocí technologie MiSeq Illumina (párový konec), zacílením na oblasti V3-V5. Čtení řízená kvalitou budou analyzována pomocí 1) přístupů založených na taxonomii, jako je Global Alignment for Sequence Taxonomy (GAST)15 a nástroj Ribosomal Database Project MultiClassifier a 2) netaxonomických shlukových algoritmů pro určení operační taxonomické jednotky pomocí UPARSE potrubí. Indexy alfa-diverzity (pozorované druhy, Shannon, Simpson) a β-diverzity (Bray-Curtis, binární Jaccard) budou počítány v QIIME a R (VEGAN balíček). Ordinační grafy pro metriky β-diverzity budou generovány neparametrickou multidimenzionální škálovací ordinací v R. Pro posouzení funkčního složení mikrobiomu bude odvozen genový obsah mikrobiální komunity pomocí algoritmu PICRUSt16. PICRUST využívá informace o obsahu genu a počtu kopií genu 16S rRNA z databáze IMG (integrované mikrobiální genomy) k predikci, které geny jsou přítomny v organismech experimentálních vzorků. Tabulky OTU generované pomocí QIIME/UPARSE budou normalizovány počtem kopií genu 16S rRNA a tyto normalizované hodnoty se vynásobí vypočítaným množstvím genových rodin v každém taxonu během procedury odvození obsahu genu prováděné pomocí PICRUSt. Výsledkem je tabulka počtů genových rodin, která je srovnatelná s těmi, které generují anotační kanály metagenomů, jako je HUMAnN a MG-RAST, a které lze organizovat do metabolických drah. Nakonec bude kvantifikován příspěvek každé OTU k dané genové funkci. K identifikaci mikrobiálních populací a metabolických drah s odlišnou četností v různých skupinách bude použit algoritmus LDA (Linear Discriminant Analysis) Effect Size (LEfSe) s online rozhraním Galaxy (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy /vykořenit).

Metabolomika moči a séra: Vzorky moči a krve budou odebrány během klinické návštěvy subjektu. Vzorky moči budou odebírány ve standardní nádobě na odběr moči obsahující azid sodný, aby se zabránilo růstu bakterií, a po odběru zmraženy. Vzorky krve budou odebírány do heparinizovaných odběrových zkumavek v době rutinního klinicky indikovaného odběru krve, konkrétně šest týdnů před operací a tři a devět měsíců po operaci. Sérum bude izolováno centrifugací při 2 000 g po dobu 10 minut po odběru a skladováno při -80 °C. Vzorky moči a séra budou použity pro metabolomické profilování pomocí NMR spektroskopie v každém časovém bodě.

Metabolomické profilování bude provedeno pomocí NMR spektroskopie prostřednictvím Metabolomics Innovation Center na University of Alberta. Vzorky budou měřeny na 4kanálovém NMR spektrometru Varian INOVA 600 MHz. Budou dodrženy standardní parametry získávání a zpracování Chenomx. 1H-NMR analýza pomocí softwaru Chenomx NMR Suite umožní současnou identifikaci až 300 malých molekul. Výsledná NMR spektra budou podrobena analýze za použití techniky cíleného profilování porovnáním spekter se známou referenční databází k identifikaci metabolitů.

Zánětlivé cytokiny a chemokiny: Sérum bude hodnoceno pro měření rychlosti sedimentace erytropoetinu (ESR) a C-reaktivního proteinu (CRP) jako měření systémového zánětu a LPS jako měření bakteriální translokace.

Vzorky séra i tkáně budou analyzovány na zánětlivé cytokiny a chemokiny. Vzorky tkání budou odebrány členem studijního týmu v době operace. U pacientů s SG bude odebrán vzorek sliznice ze žaludku au pacientů s RYGB ze žaludku i jejuna, bleskově zmražen na operačním sále pomocí tekutého dusíku a následně uložen při -80 °C. Tyto vzorky se odebírají jako standardní součást procedur. Budou analyzovány na zánětlivé cytokiny. Vyšetřovatelé v předchozích studiích navázali dobré pracovní vztahy s personálem operačních sálů a chirurgy v našich městech, což tento proces usnadní.

Imunitní odpověď hostitele bude hodnocena ve vzorcích proteinovou expresí cytokinů a chemokinů pomocí platformy Meso Scale Discovery (MSD, Gaithersburg, Maryland USA). Použití této multi-array technologie nám poskytne dynamický rozsah a citlivost pro měření velkého počtu zánětlivých a homeostatických signálů současně v jediném vzorku. Vyšetřovatelé se zpočátku zaměří na cytokin zapojený do drah receptoru Farnesoid X, vzhledem k zjevnému vztahu mezi bariatrickou chirurgií, ztrátou hmotnosti a žlučovými kyselinami17. Konkrétně tyto cytokiny zahrnují IL-lp, IL-6, IL-8, IL-12, TNFa a MCP-1.

Analýza: Přístup systémové biologie bude použit ke kombinaci metagenomiky, metabolomiky a multiplexního imunitního profilování k definování kombinovaných mikrobiálních, metabolických a imunologických změn, ke kterým dochází po bariatrické operaci. Rozdíly mezi spojitými proměnnými a výsledkem budou posouzeny Wilcoxonovým rank sum testem. Rozdíly mezi kategorickými vysvětlujícími proměnnými a výsledkem budou hodnoceny chí-kvadrát testem nebo Fisherovým přesným testem, když je velikost buněk <5. Proměnné významné na úrovni p < 0,10 testováním poměru pravděpodobnosti z jednorozměrné logistické regrese budou vloženy do vícerozměrné logistické regrese. Použije se postup zpětného postupného výběru a ty proměnné s poměrem pravděpodobnosti p-hodnota <0,05 budou zachovány v modelu s více proměnnými. QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology), MEGAN (METaGenome Analyzer) a Metastats budou prováděny s využitím odborných znalostí vyvinutých na CEGIIR a ve spolupráci s Dr. Gane Wongem, expertem na systémovou biologii.

OMEZENÍ

• Použitelnost změn v bariatrické chirurgii na hubnutí obecně
• Rozlišení příčiny a následku změn
• Posouzení vlivu dietních změn po a před operací