Микробиология бариатрической хирургии

ГИПОТЕЗА Исследователи предполагают, что кишечный микробный дисбиоз и снижение разнообразия способствует развитию и сохранению ожирения. Эффект дисбиоза является многофакторным и включает снижение барьерной функции кишечника и возникающее в результате местное и системное воспаление, которое провоцирует метаболический синдром. Измененная физиология кишечника после RYGB и SG приведет к идентифицируемым изменениям в конкретных микробных популяциях и увеличению разнообразия. Конкретные полезные микробные изменения впоследствии приведут к снижению веса, уменьшению воспаления и нормализации метаболического профиля.

МЕТОДЫ Исследуемая популяция: пациенты будут набираться из специализированной бариатрической клиники для взрослых в Эдмонтоне при больнице Royal Alexandra.

Размер выборки: в каждой когорте RYGB, SG и нехирургического диетического контроля будет 30 пациентов (всего n = 90). Предыдущие исследования включали 15 или менее участников на группу.

Расчет размера выборки. Расчет размера выборки был разработан для обеспечения адекватного учета микробных изменений, вызванных хирургическим вмешательством. В предшествующей литературе упоминались важные виды бактерий, продуцирующих короткоцепочечные жирные кислоты (F. prausnitzii) относительная численность была ниже в группе после RYGB по сравнению с неоперативным контролем (0,031 против 0,053 σ 0,024). При альфа 0,05 и бета 0,90 для этого потребуется 26 субъектов на руку. Включая показатель отсева 10%, это увеличивается до 30 субъектов на группу.

Дизайн исследования: в группе вмешательства субъекты будут включены в исследование в то время, когда им назначена операция. Образцы кала, мочи и крови будут взяты в клинике за 2-6 недель до операции. В послеоперационном периоде сбор кала будет производиться при плановых визитах в клинику через три и девять месяцев. Все предоперационные образцы будут собраны до того, как субъекты начнут 2-4-недельную предоперационную жидкость, предназначенную для уменьшения гепатомегалии и облегчения технических хирургических аспектов процедуры.

Нехирургическим контролем будут пациенты, которых лечат диетическими и поведенческими вмешательствами для снижения веса. Это включает в себя изменения диеты и активности и исключает замещение пищи или фармакологические вмешательства. Для этой когорты у субъектов будут взяты первоначальные образцы (фекалии, мочи, крови) до начала вмешательств по снижению веса. Дальнейший отбор проб будет проводиться через три и девять месяцев после начала вмешательства.

Обработка образцов и иммунный анализ будут проводиться в Центре передового опыта исследований желудочно-кишечного воспаления и иммунитета (CEGIIR) Университета Альберты. Секвенирование будет проводиться Центром прикладной геномики в рамках CEGIIR, а метаболомика будет проводиться в Центре метаболомных инноваций Университета Альберты в качестве платы за услугу.

Микробный анализ фекалий: сбор образцов фекалий будет осуществляться в соответствии с ранее разработанным протоколом, используемым нашей группой для изучения диеты при воспалительных заболеваниях кишечника. Пациентам будут предоставлены чашки для сбора проб, и их проинструктируют собрать образец накануне вечером или утром в день приема. Субъекты будут проинструктированы временно хранить образец в холодильнике. Образцы кала будут проанализированы на микробный состав, воспалительные сигналы и фекальный кальпротектин.

Состав микробного сообщества образцов фекалий будет оцениваться с помощью анализа гена 16S рРНК. ДНК будет извлечена из гомогенатов фекалий путем ферментативного и механического лизиса клеток с помощью набора QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США). Состав фекальной микробиоты будет характеризоваться секвенированием метки 16S рРНК с использованием технологии MiSeq Illumina (конец пары), нацеленной на области V3-V5. Чтения с контролируемым качеством будут проанализированы с использованием 1) таксономических подходов, таких как глобальное выравнивание для таксономии последовательностей (GAST)15 и инструмент MultiClassifier проекта рибосомной базы данных, и 2) нетаксономических алгоритмов кластеризации для определения рабочих таксономических единиц с помощью UPARSE. трубопровод. Альфа-разнообразие (наблюдаемые виды, Шеннон, Симпсон) и индексы β-разнообразия (Брэя-Кертиса, бинарного Жаккара) будут рассчитаны в QIIME и R (пакет VEGAN). Графики ординации для показателей β-разнообразия будут генерироваться с помощью непараметрической многомерной ординации масштабирования в R. Для оценки функционального состава микробиома содержание генов микробного сообщества будет выведено с использованием алгоритма PICRUSt16. PICRUSt использует информацию о содержании генов и количестве копий гена 16S рРНК из базы данных IMG (интегрированные микробные геномы), чтобы предсказать, какие гены присутствуют в организмах экспериментальных образцов. Таблицы OTU, сгенерированные с помощью QIIME/UPARSE, будут нормализованы по количеству копий гена 16S рРНК, и такие нормализованные значения умножаются на вычисленное количество семейств генов в каждом таксоне во время процедуры вывода о содержании генов, выполняемой с помощью PICRUSt. Результатом является таблица подсчета семейств генов, сравнимая с таблицами, созданными конвейерами аннотации метагенома, такими как HUMAnN и MG-RAST, и которые могут быть организованы в метаболические пути. Наконец, будет количественно определен вклад каждой OTU в данную функцию гена. Для идентификации микробных популяций и метаболических путей с различной численностью в разных группах будет использоваться алгоритм LDA (линейный дискриминантный анализ) Effect Size (LEfSe) с онлайн-интерфейсом Galaxy (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy). /корень).

Метаболомика мочи и сыворотки: Во время визита субъекта в клинику берутся образцы мочи и крови. Образцы мочи будут собираться в стандартную банку для сбора мочи, содержащую азид натрия для предотвращения роста бактерий, и после сбора замораживаются. Образцы крови будут собираться в пробирки с гепарином во время обычного анализа крови по клиническим показаниям, в частности, за шесть недель до операции и через три и девять месяцев после операции. Сыворотку выделяют центрифугированием при 2000 g в течение 10 минут после сбора и хранят при температуре -80⁰C. Образцы мочи и сыворотки будут использоваться для профилирования метаболомики с использованием ЯМР-спектроскопии в каждый момент времени.

Метаболомное профилирование будет проводиться с помощью ЯМР-спектроскопии в Инновационном центре метаболомики в Университете Альберты. Образцы будут анализироваться на 4-канальном ЯМР-спектрометре Varian INOVA 600 МГц. Будут соблюдены стандартные параметры сбора данных и обработки Chenomx. 1 H-ЯМР-анализ с использованием программного обеспечения Chenomx NMR Suite позволит одновременно идентифицировать до 300 малых молекул. Полученные спектры ЯМР будут подвергнуты анализу с использованием метода целевого профилирования, сравнения спектров с известной эталонной базой данных для идентификации метаболитов.

Воспалительные цитокины и хемокины. Сыворотку оценивают для измерения скорости оседания эритропоэтина (СОЭ) и С-реактивного белка (СРБ) для измерения системного воспаления и ЛПС для измерения бактериальной транслокации.

Образцы сыворотки и ткани будут проанализированы на наличие воспалительных цитокинов и хемокинов. Образцы тканей будут взяты членом исследовательской группы во время операции. Образец слизистой оболочки желудка будет взят у пациентов с SG, а также из желудка и тощей кишки у пациентов с RYGB, подвергнут мгновенной заморозке в операционной с использованием жидкого азота и впоследствии будет храниться при температуре -80⁰C. Эти образцы удаляются как стандартная часть процедуры. Они будут проанализированы на воспалительные цитокины. Исследователи установили хорошие рабочие отношения с персоналом операционных и хирургами в наших городах в предыдущих исследованиях, которые облегчат этот процесс.

Иммунный ответ хозяина будет оцениваться в образцах по белковой экспрессии цитокинов и хемокинов с использованием платформы Meso Scale Discovery (MSD, Gaithersburg, Maryland USA). Использование этой технологии с несколькими массивами предоставит нам динамический диапазон и чувствительность для одновременного измерения большого количества воспалительных и гомеостатических сигналов в одном образце. Исследователи первоначально сосредоточатся на цитокине, участвующем в путях рецептора Farnesoid X, учитывая очевидную связь между бариатрической хирургией, потерей веса и желчными кислотами17. В частности, эти цитокины включают IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, TNFα и MCP-1.

Анализ: будет использоваться подход системной биологии для объединения метагеномики, метаболомики и мультиплексного иммунного профилирования для определения комбинированных микробных, метаболических и иммунологических изменений, которые происходят после бариатрической хирургии. Различия между непрерывными переменными и результатом будут оцениваться с помощью критерия суммы рангов Уилкоксона. Различия между категориальными независимыми переменными и результатом будут оцениваться с помощью критерия хи-квадрат или точного критерия Фишера, если размер ячейки <5. Переменные, значимые на уровне p <0,10 при проверке отношения правдоподобия из одномерной логистической регрессии, будут введены в многомерную логистическую регрессию. Будет использоваться обратная пошаговая процедура отбора, и те переменные, у которых отношение правдоподобия p-значение <0,05, будут поддерживаться в многопараметрической модели. QIIME (Количественный анализ микробной экологии), MEGAN (MEtaGenome Analyzer) и Metastats будут проводиться с использованием опыта, разработанного в CEGIIR, и в сотрудничестве с доктором Гейном Вонгом, экспертом по системной биологии.

ОГРАНИЧЕНИЯ

• Применимость изменений в бариатрической хирургии для снижения веса в целом
• Дифференциация причины и следствия изменений
• Оценка влияния диетических изменений после и до операции