Bariatrisen kirurgian mikrobiologia

HYPOTEESI Tutkijat olettavat, että suoliston mikrobien dysbioosi ja monimuotoisuuden väheneminen edistävät liikalihavuuden kehittymistä ja jatkumista. Dysbioosin vaikutus on monitekijäinen ja sisältää suoliston estetoiminnan heikkenemisen ja siitä johtuvan paikallisen ja systeemisen tulehduksen, joka kiihottaa metabolista oireyhtymää. RYGB:n ja SG:n jälkeen muuttunut suoliston fysiologia johtaa tunnistettavissa oleviin muutoksiin tietyissä mikrobipopulaatioissa ja monimuotoisuuden lisääntymiseen. Erityiset hyödylliset mikrobimuutokset johtavat myöhemmin painonpudotukseen, tulehduksen vähenemiseen ja normalisoituun aineenvaihduntaprofiiliin.

MENETELMÄT Tutkimuspopulaatio: Potilaat rekrytoidaan Royal Alexandran sairaalan Edmonton Adult Specialty Bariatric Clinic -klinikalta.

Näytteen koko: Jokaisessa RYGB-, SG- ja ei-kirurgisten ruokavaliokontrollien kohortissa on 30 potilasta (yhteensä n = 90). Aiemmissa tutkimuksissa on ollut 15 tai vähemmän osallistujaa käsiä kohti.

Näytteen koon laskenta: Näytteen koon laskenta suunniteltiin sen varmistamiseksi, että tutkimuksessa otetaan riittävästi huomioon leikkauksen aiheuttamat mikrobimuutokset. Aikaisemmassa kirjallisuudessa tärkeä lyhytketjuinen rasvahappoja tuottava bakteerilaji" (F. prausnitzii) suhteellinen runsaus oli pienempi RYGB:n jälkeisessä ryhmässä verrattuna ei-leikkauksiin (0,031 v. 0,053 σ 0,024). Alfa-arvolla 0,05 ja beeta-arvolla 0,90 tämä vaatisi 26 koehenkilöä käsiä kohti. Mukaan lukien 10 %:n keskeyttämisaste, tämä kasvaa 30 koehenkilöön per käsi.

Tutkimuksen suunnittelu: Interventioryhmässä koehenkilöt otetaan mukaan leikkausaikana. Uloste-, virtsa- ja verinäytteet otetaan klinikalla 2-6 viikkoa ennen leikkausta. Leikkauksen jälkeisenä aikana ulostekeräys tapahtuu kolmen ja yhdeksän kuukauden määräaikaisilla klinikkakäynneillä. Kaikki leikkausta edeltävät näytteet kerätään ennen kuin potilaat aloittavat 2–4 viikon preoperatiivisen nesteen, joka on suunniteltu vähentämään hepatomegaliaa ja helpottamaan toimenpiteen teknisiä kirurgisia puolia.

Ei-kirurgiset kontrollit ovat potilaat, joita hoidetaan ruokavalio- ja käyttäytymistoimenpiteillä painonpudotuksen vuoksi. Tämä sisältää ruokavalion ja aktiivisuuden muutokset, eikä aterian korvaamista tai farmakologisia toimenpiteitä. Tämän kohortin osalta koehenkilöiltä otetaan ensimmäinen näyte (uloste, virtsa, veri) ennen painonpudotustoimenpiteiden aloittamista. Seuraavat näytteet otetaan sitten kolmen ja yhdeksän kuukauden kuluttua toimenpiteen aloittamisesta.

Näytteiden käsittely ja immuunianalyysi suoritetaan Albertan yliopiston gastrointestinaalisen tulehduksen ja immuniteettitutkimuksen huippuyksikössä (CEGIIR). Sekvensoinnin suorittaa CEGIIR:n Applied Genomics Center ja metabolomiikka Albertan yliopiston Metabolomic Innovation Centerissä palvelumaksuna.

Ulosteen mikrobianalyysi: Ulostenäytteiden keräämistä ohjaa aiemmin kehitetty protokolla, jota ryhmämme on käyttänyt tulehduksellisen suolistosairauden ruokavaliotutkimuksissa. Potilaille toimitetaan keräyskupit ja heitä neuvotaan ottamaan näyte vastaanottoa edeltävänä iltana tai aamuna. Koehenkilöitä neuvotaan säilyttämään näyte jääkaapissa tällä välin. Ulostenäytteistä analysoidaan mikrobikoostumus, tulehdussignaalit ja ulosteen kalprotektiini.

Ulostenäytteiden mikrobiyhteisön koostumus arvioidaan käyttämällä 16S-rRNA-geenianalyysejä. DNA uutetaan ulostehomogenaateista yhdistämällä entsymaattinen ja mekaaninen solulyysi QIAamp DNA Stool Mini Kit -sarjan kanssa (Qiagen, Valencia, CA, USA). Ulosteen mikrobiston koostumus karakterisoidaan 16S rRNA -merkkisekvensoinnilla käyttämällä MiSeq Illumina -tekniikkaa (paripää) kohdentamalla V3-V5-alueille. Laatukontrolloituja lukuja analysoidaan käyttämällä 1) taksonomiseen perustuvia lähestymistapoja, kuten Global Alignment for Sequence Taxonomy (GAST)15 ja Ribosomal Database Project MultiClassifier -työkalua ja 2) ei-taksonomiaan perustuvia klusterointialgoritmeja operatiivisen taksonomisen yksikön määrittämiseen UPARSE:n avulla. putki. Alfa-diversiteetti (havaitut lajit, Shannon, Simpson) ja β-diversiteettiindeksit (Bray-Curtis, binaarinen Jaccard) lasketaan QIIME:ssä ja R:ssä (VEGAN-paketti). Ordinaatiokuvaajat β-diversiteettimittauksille luodaan ei-parametrisella moniulotteisella skaalausordinaatiolla R:ssä. Mikrobiomin toiminnallisen koostumuksen arvioimiseksi mikrobiyhteisön geenisisällöstä päätellään PICRUSt-algoritmin avulla16. PICRUSt käyttää IMG-tietokannan (integrated microbial genomes) tietoja geenisisällöstä ja 16S-rRNA-geenin kopionumerosta ennustaakseen, mitä geenejä koenäytteiden organismeissa on. QIIME/UPARSE:lla luodut OTU-taulukot normalisoidaan 16S-rRNA-geenin kopioluvulla ja tällaiset normalisoidut arvot kerrotaan kunkin taksonin geeniperheiden laskennallisella määrällä PICRUSt:lla suoritetun geenisisällön päättelymenettelyn aikana. Tuloksena on taulukko geeniperheiden lukumäärästä, joka on verrattavissa metagenomiannotaatioputkien, kuten HUMANN ja MG-RAST, tuottamiin lukuihin, ja joka voidaan järjestää aineenvaihduntareiteiksi. Lopuksi määritetään kunkin OTU:n osuus tiettyyn geenitoimintoon. Mikrobipopulaatioiden ja aineenvaihduntareittien tunnistamiseksi eri ryhmissä erottuvalla runsaudella, LDA (Linear Discriminant Analysis) Effect Size (LEfSe) -algoritmia käytetään online-käyttöliittymän Galaxy (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy) kanssa. /juuri).

Virtsan ja seerumin metabolomiikka: Virtsa- ja verinäytteet kerätään potilaan klinikkakäynnin aikana. Virtsanäytteet otetaan tavalliseen virtsankeräysastiaan, joka sisältää natriumatsidia bakteerien kasvun estämiseksi, ja jäädytetään keräämisen jälkeen. Verinäytteet otetaan heparinisoituihin keräysputkiin rutiininomaisen kliinisesti indikoidun verityön yhteydessä, erityisesti kuusi viikkoa ennen leikkausta ja kolme ja yhdeksän kuukautta leikkauksen jälkeen. Seerumi eristetään sentrifugoimalla 2 000 g:ssä 10 minuutin ajan keräämisen jälkeen ja säilytetään -80 °C:ssa. Virtsa- ja seeruminäytteitä käytetään metabolomiikan profilointiin käyttäen NMR-spektroskopiaa joka ajankohtana.

Aineenvaihduntaprofilointi tehdään NMR-spektroskopialla Albertan yliopiston Metabolomics Innovation Centerin kautta. Näytteet ajetaan 4-kanavaisella Varian INOVA 600 MHz NMR-spektrometrillä. Tavallisia Chenomx-hankinta- ja -käsittelyparametreja noudatetaan. 1H-NMR-analyysi käyttäen Chenomx NMR Suite -ohjelmistoa mahdollistaa jopa 300 pienen molekyylin samanaikaisen tunnistamisen. Tuloksena saadut NMR-spektrit alistetaan analyysiin käyttämällä kohdennettua profilointitekniikkaa vertaamalla spektrejä tunnettuun vertailutietokantaan metaboliittien tunnistamiseksi.

Tulehdukselliset sytokiinit ja kemokiinit: Seerumi arvioidaan erytropoietiinin sedimentaationopeuden (ESR) ja C-reaktiivisen proteiinin (CRP) mittaamiseksi systeemisen tulehduksen mittauksena ja LPS:n mittaamiseksi bakteerien translokaation mittaamiseksi.

Sekä seerumi- että kudosnäytteistä analysoidaan tulehdukselliset sytokiinit ja kemokiinit. Tutkimusryhmän jäsen ottaa kudosnäytteet leikkauksen yhteydessä. Limakalvonäyte otetaan mahasta SG-potilailla ja sekä mahasta että jejunumista RYGB-potilailla, jäädytetään leikkaussalissa nestemäisellä typellä ja säilytetään sen jälkeen -80 ⁰C:ssa. Nämä näytteet poistetaan toimenpiteiden normaalina osana. Niistä analysoidaan tulehdukselliset sytokiinit. Aiemmissa tutkimuksissa tutkijat ovat luoneet hyvän työsuhteen leikkaussalien henkilökunnan ja kirurgien kanssa eri puolilla kaupunkia, mikä helpottaa tätä prosessia.

Isännän immuunivaste arvioidaan näytteissä sytokiinien ja kemokiinien proteiiniekspressiolla käyttämällä Meso Scale Discovery -alustaa (MSD, Gaithersburg, Maryland USA). Tämän multi-array-tekniikan käyttö antaa meille dynaamisen alueen ja herkkyyden mitata useita tulehduksellisia ja homeostaattisia signaaleja samanaikaisesti yhdessä näytteessä. Tutkijat keskittyvät aluksi Farnesoid X -reseptoreihin osallistuviin sytokiiniin, kun otetaan huomioon bariatrisen leikkauksen, painonpudotuksen ja sappihappojen välinen ilmeinen suhde17. Erityisesti näihin sytokiineihin kuuluvat IL-1p, IL-6, IL-8, IL-12, TNFa ja MCP-1.

Analyysi: Systeemibiologian lähestymistapaa käytetään yhdistämään metagenomiikka, metabolomiikka ja multipleksinen immuuniprofilointi, jotta voidaan määritellä yhdistetyt mikrobiaaliset, metaboliset ja immunologiset muutokset, joita esiintyy bariatrisen leikkauksen jälkeen. Jatkuvien muuttujien ja tuloksen väliset erot arvioidaan Wilcoxonin ranksusummatestillä. Kategoristen selittävien muuttujien ja tuloksen väliset erot arvioidaan khin neliötestillä tai Fisherin tarkalla testillä, kun solukoko on <5. Muuttujat, jotka ovat merkitseviä tasolla p < 0,10 todennäköisyyssuhdetestauksella yksimuuttujalogistisesta regressiosta, viedään monimuuttujalogistiseen regressioon. Taaksepäin vaiheittaista valintamenettelyä käytetään ja ne muuttujat, joiden todennäköisyyssuhde p-arvo <0,05, säilytetään monimuuttujamallissa. QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology), MEGAN (MEtaGenome Analyzer) ja Metastats suoritetaan käyttämällä CEGIIR:ssä kehitettyä asiantuntemusta ja yhteistyössä systeemibiologian asiantuntijan tohtori Gane Wongin kanssa.

RAJOITUKSET

• Bariatrisen kirurgian muutosten soveltuvuus painonpudotukseen yleensä
• Muutosten syyn ja seurauksen erottaminen
• Leikkauksen jälkeisten ja sitä edeltävien ruokavaliomuutosten vaikutusten arviointi