Bariatrisk kirurgis mikrobiologi

HYPOTESE Efterforskerne antager, at tarmmikrobiel dysbiose og et fald i diversitet bidrager til udviklingen og opretholdelsen af ​​fedme. Effekten af ​​dysbiose er multifaktoriel og inkluderer et fald i tarmbarrierefunktionen og deraf følgende lokal og systemisk inflammation, der ansporer til det metaboliske syndrom. Den ændrede tarmfysiologi efter RYGB og SG vil føre til identificerbare ændringer i specifikke mikrobielle populationer og en stigning i diversitet. Specifikke gavnlige mikrobielle ændringer vil efterfølgende resultere i vægttab, reduceret inflammation og en normaliseret metabolisk profil.

METODER Undersøgelsespopulation: Patienter vil blive rekrutteret fra Edmonton Adult Specialty Bariatric Clinic på Royal Alexandra hospitalet.

Prøvestørrelse: Hver kohorte af RYGB, SG og ikke-kirurgiske diætkontroller vil have 30 patienter (i alt n = 90). Tidligere undersøgelser har inkluderet 15 eller færre deltagere pr. arm.

Prøvestørrelsesberegning: Prøvestørrelsesberegning blev designet til at sikre, at undersøgelsen tilstrækkeligt ville fange mikrobielle ændringer induceret af kirurgi. I tidligere litteratur er en vigtig kortkædet fedtsyreproducerende bakterieart' (F. prausnitzii) relativ overflod var lavere i en post-RYGB-gruppe sammenlignet med ikke-operative kontroller (0,031 v. 0,053 σ 0,024). Med en alfa på 0,05 og en Beta på 0,90 ville dette kræve 26 forsøgspersoner pr. arm. Inklusive en frafaldsrate på 10 %, stiger dette til 30 forsøgspersoner pr. arm.

Undersøgelsesdesign: Til interventionsarmen vil forsøgspersoner blive indskrevet på det tidspunkt, de er planlagt til operation. Fækal-, urin- og blodprøver vil blive indsamlet på klinikken 2-6 uger før operationen. I den postoperative periode vil fækal opsamling finde sted ved planlagte tre- og ni-måneders klinikbesøg. Alle præoperative prøver vil blive indsamlet før forsøgspersoner påbegynder en 2-4 ugers præoperativ væske designet til at reducere hepatomegali og lette de tekniske kirurgiske aspekter af proceduren.

Ikke-kirurgiske kontroller vil være patienter, der behandles med diæt- og adfærdsmæssige interventioner for vægttab. Dette inkluderer kost- og aktivitetsændringer og udelukker måltidserstatning eller farmakologiske indgreb. For denne kohorte vil forsøgspersonerne få taget første prøveudtagning (fækal, urin, blod) før påbegyndelse af vægttabsinterventioner. Yderligere prøveudtagning vil så finde sted tre måneder og ni måneder efter påbegyndelse af interventionen.

Prøvebehandling og immunanalyse vil finde sted på Center of Excellence for Gastrointestinal Inflammation and Immunity Research (CEGIIR) ved University of Alberta. Sekvensering vil blive udført af Applied Genomics Center inden for CEGIIR, og metabolomics vil blive udført på Metabolomic Innovation Center ved University of Alberta som et gebyr for service.

Fækal mikrobiel analyse: Indsamling af fækal prøve vil blive drevet af en tidligere udviklet protokol brugt af vores gruppe til diætundersøgelser i inflammatorisk tarmsygdom. Indsamlingsbægre vil blive udleveret til patienterne, og de vil blive bedt om at tage en prøve natten før eller morgenen efter deres aftale. Forsøgspersoner vil blive instrueret i at opbevare prøven i køleskabet i mellemtiden. Fækale prøver vil blive analyseret for mikrobiel sammensætning, inflammatoriske signaler og fækalt calprotectin.

Den mikrobielle samfundssammensætning af fækale prøver vil blive vurderet ved hjælp af 16S rRNA-genanalyser. DNA vil blive ekstraheret fra de fækale homogenater, der kombinerer enzymatisk og mekanisk cellelyse med QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Fækal mikrobiota-sammensætning vil blive karakteriseret ved 16S rRNA-tag-sekventering ved hjælp af MiSeq Illumina-teknologien (par-ende), målrettet mod V3-V5-regionerne. Kvalitetskontrollerede læsninger vil blive analyseret ved hjælp af 1) taksonomisk-baserede tilgange såsom Global Alignment for Sequence Taxonomy (GAST)15 og Ribosomal Database Project MultiClassifier-værktøjet og 2) ikke-taksonomisk-baserede klyngealgoritmer til operationel taksonomisk enhedsbestemmelse med UPARSE rørledning. Alfa-diversitet (observerede arter, Shannon, Simpson) og β-diversitetsindekser (Bray-Curtis, binær Jaccard) vil blive beregnet i QIIME og R (VEGAN-pakke). Ordinationsplot for β-diversitetsmetrikker vil blive genereret ved ikke-parametrisk multidimensionel skaleringsordination i R. For at vurdere mikrobiomets funktionelle sammensætning vil genindholdet i det mikrobielle samfund blive udledt ved hjælp af PICRUST-algoritmen16. PICRUST bruger information om genindhold og 16S rRNA-genkopinummer fra IMG-databasen (integrated microbial genomes) til at forudsige, hvilke gener der er til stede i organismerne i de eksperimentelle prøver. OTUs-tabeller genereret med QIIME/UPARSE vil blive normaliseret af 16S rRNA-genkopinummer, og sådanne normaliserede værdier multipliceres med den beregnede mængde af genfamilier i hver taxon under genindholdsslutningsproceduren udført med PICRUST. Resultatet er en tabel over genfamilietællinger, der kan sammenlignes med dem, der genereres af metagenomannoteringspipelines, såsom HUManN og MG-RAST, og som kan organiseres i metaboliske veje. Endelig vil bidraget fra hver OTU til en given genfunktion blive kvantificeret. For at identificere mikrobielle populationer og metaboliske veje med differentierende overflod i de forskellige grupper, vil LDA (Linear Discriminant Analysis) Effect Size (LEfSe)-algoritmen blive brugt med online-grænsefladen Galaxy (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy) /rod).

Urin- og serummetabolomik: Urin- og blodprøver vil blive indsamlet under forsøgspersonens klinikbesøg. Urinprøver vil blive taget i en standard urinopsamlingsbeholder indeholdende natriumazid for at forhindre bakterievækst, og frosset efter opsamling. Blodprøver vil blive opsamlet i hepariniserede prøvetagningsrør på tidspunktet for rutinemæssigt klinisk indiceret blodarbejde, specifikt seks uger før operationen og tre og ni måneder efter operationen. Serum vil blive isoleret ved centrifugering ved 2 000 g i 10 minutter efter opsamling og opbevaret ved -80 ⁰C. Urin- og serumprøver vil blive brugt til metabolomisk profilering ved hjælp af NMR-spektroskopi på hvert tidspunkt.

Metabolomisk profilering vil blive udført med NMR-spektroskopi gennem Metabolomics Innovation Center ved University of Alberta. Prøver vil blive kørt på et 4-kanals Varian INOVA 600 MHz NMR-spektrometer. Standard Chenomx erhvervelse og behandling parametre vil blive fulgt. 1H-NMR-analyse ved hjælp af Chenomx NMR Suite-software vil muliggøre samtidig identifikation af op til 300 små molekyler. De resulterende NMR-spektre vil blive udsat for analyse ved hjælp af teknikken med målrettet profilering, der sammenligner spektre med en kendt referencedatabase for at identificere metabolitter.

Inflammatoriske cytokiner og kemokiner: Serum vil blive vurderet til måling af erythropoietin sedimentationshastighed (ESR) og C-reaktivt protein (CRP) som målinger af systemisk inflammation, og LPS, som en måling af bakteriel translokation.

Både serum- og vævsprøver vil blive analyseret for inflammatoriske cytokiner og kemokiner. Vævsprøver vil blive indsamlet af et medlem af undersøgelsesteamet på operationstidspunktet. En slimhindeprøve fra maven vil blive indsamlet til SG-patienter og fra både maven og jejunum til RYGB-patienter, flash-frosset på operationsstuen ved hjælp af flydende nitrogen og efterfølgende opbevaret ved -80⁰C. Disse prøver fjernes som en standarddel af procedurerne. De vil blive analyseret for inflammatoriske cytokiner. Efterforskerne har etableret et godt samarbejde med operationspersonale og kirurger rundt omkring i vores byer i tidligere undersøgelser, som vil lette denne proces.

Værts immunrespons vil blive vurderet i prøver ved proteinekspression af cytokiner og kemokiner ved hjælp af Meso Scale Discovery platformen (MSD, Gaithersburg, Maryland USA). Brug af denne multi-array-teknologi vil give os et dynamisk område og følsomheden til at måle et stort antal inflammatoriske og homøostatiske signaler samtidigt i en enkelt prøve. Forskerne vil i første omgang fokusere på cytokin involveret i Farnesoid X-receptorvejene, givet det tilsyneladende forhold mellem fedmekirurgi, vægttab og galdesyrer17. Specifikt omfatter disse cytokiner IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, TNFa og MCP-1.

Analyse: En systembiologisk tilgang vil blive brugt til at kombinere metagenomics, metabolomics og multiplex immunprofilering for at definere de kombinerede mikrobielle, metaboliske og immunologiske ændringer, der opstår efter bariatrisk kirurgi. Forskelle mellem kontinuerte variable og udfald vil blive vurderet ved Wilcoxon rank sum test. Forskelle mellem kategoriske forklarende variabler og resultatet vil blive vurderet ved chi-kvadrat-testen eller Fishers eksakte test, når cellestørrelsen er <5. Variabler, der er signifikante på p < 0,10-niveauet ved test af sandsynlighedsratio fra univariat logistisk regression, vil blive indtastet i multivariabel logistisk regression. En baglæns trinvis udvælgelsesprocedure vil blive brugt, og de variable med en sandsynlighedsratio p-værdi <0,05 vil blive opretholdt i den multivariable model. QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology), MEGAN (MEtaGenome Analyzer) og Metastats, vil blive udført ved hjælp af den ekspertise, der er udviklet på CEGIIR og i samarbejde med Dr. Gane Wong, en systembiologisk ekspert.

BEGRÆNSNINGER

• Anvendelse af ændringer i fedmekirurgi til vægttab generelt
• Differentiering af årsag og virkning af ændringer
• Vurdering af effekt af kostændringer efter og forudgående operation