Mikrobiologien til bariatrisk kirurgi

HYPOTESE Etterforskerne antar at intestinal mikrobiell dysbiose og en reduksjon i mangfold bidrar til utvikling og opprettholdelse av fedme. Effekten av dysbiose er multifaktoriell og inkluderer en reduksjon i tarmbarrierefunksjon og resulterende lokal og systemisk betennelse som stimulerer til det metabolske syndromet. Den endrede tarmfysiologien etter RYGB og SG vil føre til identifiserbare endringer i spesifikke mikrobielle populasjoner og en økning i mangfold. Spesifikke gunstige mikrobielle endringer vil deretter resultere i vekttap, redusert betennelse og en normalisert metabolsk profil.

METODER Studiepopulasjon: Pasienter vil bli rekruttert fra Edmonton Adult Specialty Bariatric Clinic ved Royal Alexandra sykehus.

Prøvestørrelse: Hver kohort av RYGB, SG og ikke-kirurgiske diettkontroller vil ha 30 pasienter (totalt n = 90). Tidligere studier har inkludert 15 eller færre deltakere per arm.

Beregning av prøvestørrelse: Beregning av prøvestørrelse ble utformet for å sikre at studien ville fange opp mikrobielle endringer indusert av kirurgi på en adekvat måte. I tidligere litteratur, en viktig kortkjedet fettsyreproduserende bakterieart' (F. prausnitzii) var relativ overflod lavere i en post-RYGB-gruppe sammenlignet med ikke-operative kontroller (0,031 v. 0,053 σ 0,024). Med en alfa på 0,05 og en Beta på 0,90, ville dette kreve 26 forsøkspersoner per arm. Inkludert et frafall på 10 %, øker dette til 30 forsøkspersoner per arm.

Studiedesign: For intervensjonsarmen vil forsøkspersoner bli registrert på tidspunktet de er planlagt for operasjon. Avførings-, urin- og blodprøver vil bli tatt på klinikken 2-6 uker før operasjonen. I den postoperative perioden vil fekal oppsamling finne sted ved planlagte tre- og ni-måneders klinikkbesøk. Alle preoperative prøver vil bli samlet inn før forsøkspersonene starter en 2-4 ukers preoperativ væske designet for å redusere hepatomegali og lette de tekniske kirurgiske aspektene ved prosedyren.

Ikke-kirurgiske kontroller vil være pasienter som behandles med kostholds- og atferdsintervensjoner for vekttap. Dette inkluderer kostholds- og aktivitetsendringer og utelukker måltidserstatning eller farmakologiske intervensjoner. For denne kohorten vil forsøkspersonene ha første prøvetaking (avføring, urin, blod) før de starter vekttapintervensjoner. Ytterligere prøvetaking vil da skje tre måneder og ni måneder etter igangsetting av intervensjonen.

Prøvebehandling og immunanalyse vil finne sted ved Center of Excellence for Gastrointestinal Inflammation and Immunity Research (CEGIIR) ved University of Alberta. Sekvensering vil bli utført av Applied Genomics Center innen CEGIIR og metabolomics vil bli utført ved Metabolomic Innovation Center ved University of Alberta som en avgift for service.

Fekal mikrobiell analyse: Innsamling av avføringsprøver vil bli drevet av en tidligere utviklet protokoll brukt av vår gruppe for diettstudier ved inflammatorisk tarmsykdom. Innsamlingskopper vil bli gitt til pasientene, og de vil bli bedt om å ta en prøve natten før eller morgenen etter avtalen. Forsøkspersonene vil bli bedt om å oppbevare prøven i kjøleskapet i mellomtiden. Avføringsprøver vil bli analysert for mikrobiell sammensetning, inflammatoriske signaler og fekalt kalprotektin.

Den mikrobielle fellesskapssammensetningen av fekale prøver vil bli vurdert ved hjelp av 16S rRNA-genanalyser. DNA vil bli ekstrahert fra fekale homogenater som kombinerer enzymatisk og mekanisk cellelyse med QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Fekal mikrobiota-sammensetning vil bli preget av 16S rRNA-tag-sekvensering ved bruk av MiSeq Illumina-teknologien (parende), rettet mot V3-V5-regionene. Kvalitetskontrollerte avlesninger vil bli analysert ved å bruke 1) taksonomisk-baserte tilnærminger som Global Alignment for Sequence Taxonomy (GAST)15 og Ribosomal Database Project MultiClassifier-verktøyet og 2) ikke-taksonomisk-baserte klyngealgoritmer for operasjonell taksonomisk enhetsbestemmelse med UPARSE rørledning. Alfa-diversitet (observerte arter, Shannon, Simpson) og β-diversitetsindekser (Bray-Curtis, binær Jaccard) vil bli beregnet i QIIME og R (VEGAN-pakke). Ordinasjonsplott for β-diversitetsmetrikker vil bli generert av ikke-parametrisk flerdimensjonal skaleringsordinasjon i R. For å vurdere den funksjonelle sammensetningen av mikrobiomet, vil geninnholdet i det mikrobielle fellesskapet bli utledet ved hjelp av PICRUST-algoritmen16. PICRUST bruker informasjon om geninnhold og 16S rRNA-genkopinummer fra IMG-databasen (integrerte mikrobielle genomer) for å forutsi hvilke gener som er tilstede i organismer i forsøksprøvene. OTUs-tabeller generert med QIIME/UPARSE vil bli normalisert med 16S rRNA-genkopinummer og slike normaliserte verdier multipliseres med den beregnede mengden av genfamilier i hvert takson under geninnholdsprosedyren utført med PICRUST. Resultatet er en tabell over genfamilietellinger som er sammenlignbare med de som genereres av metagenomannoteringsrørledninger som HUManN og MG-RAST, og som kan organiseres i metabolske veier. Til slutt vil bidraget fra hver OTU til en gitt genfunksjon kvantifiseres. For å identifisere mikrobielle populasjoner og metabolske veier med differensierende overflod i de forskjellige gruppene, vil LDA (Linear Discriminant Analysis) Effect Size (LEfSe)-algoritmen bli brukt med det elektroniske grensesnittet Galaxy (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy) /rot).

Urin- og serummetabolomikk: Urin- og blodprøver vil bli tatt under forsøkspersonens klinikkbesøk. Urinprøver vil bli tatt i en standard urinbeholder som inneholder natriumazid for å forhindre bakterievekst, og fryses etter oppsamling. Blodprøver vil bli tatt i hepariniserte prøvetakingsrør på tidspunktet for rutinemessig klinisk indisert blodprøve, nærmere bestemt seks uker før operasjonen og tre og ni måneder etter operasjonen. Serum vil bli isolert ved sentrifugering ved 2 000 g i 10 minutter etter innsamling og lagret ved -80⁰C. Urin- og serumprøver vil bli brukt til metabolomisk profilering ved bruk av NMR-spektroskopi på hvert tidspunkt.

Metabolomisk profilering vil bli gjort med NMR-spektroskopi gjennom Metabolomics Innovation Center ved University of Alberta. Prøver vil bli kjørt på et 4-kanals Varian INOVA 600 MHz NMR-spektrometer. Standard Chenomx anskaffelses- og prosesseringsparametere vil bli fulgt. 1H-NMR-analyse ved bruk av Chenomx NMR Suite-programvare vil tillate samtidig identifikasjon av opptil 300 små molekyler. De resulterende NMR-spektrene vil bli gjenstand for analyse ved å bruke teknikken med målrettet profilering som sammenligner spektra med en kjent referansedatabase for å identifisere metabolitter.

Inflammatoriske cytokiner og kjemokiner: Serum vil bli vurdert for måling av erytropoietin sedimentasjonshastighet (ESR) og C-reaktivt protein (CRP) som målinger av systemisk inflammasjon, og LPS, som måling av bakteriell translokasjon.

Både serum- og vevsprøver vil bli analysert for inflammatoriske cytokiner og kjemokiner. Vevsprøver vil bli samlet inn av et medlem av studieteamet ved operasjonstidspunktet. En slimhinneprøve fra magesekken vil bli tatt for SG-pasienter og fra både magesekk og jejunum for RYGB-pasienter, flash-fryst i operasjonssalen med flytende nitrogen og deretter lagret ved -80⁰C. Disse prøvene fjernes som en standard del av prosedyrene. De vil bli analysert for inflammatoriske cytokiner. Etterforskerne har etablert et godt samarbeid med operasjonsstaben og kirurger rundt om i byene våre i tidligere studier som vil lette denne prosessen.

Vertens immunrespons vil bli vurdert i prøver ved proteinekspresjon av cytokiner og kjemokiner ved bruk av Meso Scale Discovery-plattformen (MSD, Gaithersburg, Maryland USA). Ved å bruke denne multi-array-teknologien vil vi gi oss et dynamisk område og følsomheten til å måle et stort antall inflammatoriske og homeostatiske signaler samtidig i en enkelt prøve. Etterforskerne vil i første omgang fokusere på cytokin involvert i Farnesoid X-reseptorveiene, gitt det tilsynelatende forholdet mellom fedmekirurgi, vekttap og gallesyrer17. Spesifikt inkluderer disse cytokinene IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, TNFa og MCP-1.

Analyse: En systembiologisk tilnærming vil bli brukt for å kombinere metagenomikk, metabolomikk og multipleks immunprofilering for å definere de kombinerte mikrobielle, metabolske og immunologiske endringene som oppstår etter fedmekirurgi. Forskjeller mellom kontinuerlige variabler og utfall vil bli vurdert ved Wilcoxon rangsumtest. Forskjeller mellom kategoriske forklaringsvariabler og utfallet vil bli vurdert av kjikvadrattesten, eller Fishers eksakte test når cellestørrelsen er <5. Variabler som er signifikante på p < 0,10-nivået ved likelihood-ratiotesting fra univariat logistisk regresjon vil bli lagt inn i multivariabel logistisk regresjon. En bakover trinnvis seleksjonsprosedyre vil bli brukt og de variablene med en sannsynlighetsratio p-verdi <0,05 vil opprettholdes i den multivariable modellen. QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology), MEGAN (MEtaGenome Analyzer) og Metastats, vil bli utført ved hjelp av ekspertisen utviklet ved CEGIIR og i samarbeid med Dr. Gane Wong, en systembiologiekspert.

BEGRENSNINGER

• Anvendelse av endringer i fedmekirurgi på vekttap generelt
• Differensiere årsak og virkning av endringer
• Vurdering av effekt av kostholdsendringer etter og før operasjon