La microbiología de la cirugía bariátrica

HIPÓTESIS Los investigadores plantean la hipótesis de que la disbiosis microbiana intestinal y una disminución en la diversidad contribuyen al desarrollo y perpetuación de la obesidad. El efecto de la disbiosis es multifactorial e incluye una disminución de la función de barrera intestinal y la inflamación local y sistémica resultante que incita al síndrome metabólico. La fisiología intestinal alterada después de RYGB y SG conducirá a cambios identificables en poblaciones microbianas específicas y un aumento en la diversidad. Los cambios microbianos beneficiosos específicos darán como resultado la pérdida de peso, la reducción de la inflamación y un perfil metabólico normalizado.

MÉTODOS Población de estudio: Los pacientes serán reclutados de la Clínica Bariátrica Especializada en Adultos de Edmonton en el hospital Royal Alexandra.

Tamaño de la muestra: Cada cohorte de RYGB, SG y controles dietéticos no quirúrgicos tendrá 30 pacientes (total n = 90). Estudios anteriores han incluido 15 o menos participantes por brazo.

Cálculo del tamaño de la muestra: el cálculo del tamaño de la muestra se diseñó para garantizar que el estudio capturara adecuadamente los cambios microbianos inducidos por la cirugía. En la literatura anterior, una importante especie bacteriana productora de ácidos grasos de cadena corta (F. prausnitzii) la abundancia relativa fue menor en un grupo post-RYGB en comparación con los controles no quirúrgicos (0,031 v. 0,053 σ 0,024). Con un alfa de 0,05 y un Beta de 0,90, esto requeriría 26 sujetos por brazo. Incluyendo una tasa de abandono del 10%, esto aumenta a 30 sujetos por brazo.

Diseño del estudio: para el brazo de intervención, los sujetos se inscribirán en el momento en que estén programados para la cirugía. Se recolectarán muestras de heces, orina y sangre en la clínica de 2 a 6 semanas antes de la cirugía. En el período postoperatorio, la recolección de heces se realizará en visitas clínicas programadas a los tres y nueve meses. Todas las muestras preoperatorias se recolectarán antes de que los sujetos inicien un líquido preoperatorio de 2 a 4 semanas diseñado para reducir la hepatomegalia y facilitar los aspectos quirúrgicos técnicos del procedimiento.

Los controles no quirúrgicos serán pacientes tratados con intervenciones dietéticas y conductuales para bajar de peso. Esto incluye modificaciones dietéticas y de actividad y excluye reemplazo de comidas o intervenciones farmacológicas. Para esta cohorte, a los sujetos se les tomará una muestra inicial (heces, orina, sangre) antes de iniciar las intervenciones de pérdida de peso. Luego se realizarán más muestreos a los tres meses y nueve meses después del inicio de la intervención.

El procesamiento de muestras y el análisis inmunológico se llevarán a cabo en el Centro de Excelencia para la Investigación de Inflamación e Inmunidad Gastrointestinal (CEGIIR) en la Universidad de Alberta. La secuenciación será realizada por el Centro de Genómica Aplicada dentro de CEGIIR y la metabolómica se realizará en el Centro de Innovación Metabolómica de la Universidad de Alberta como una tarifa por el servicio.

Análisis microbiano fecal: la recolección de muestras fecales estará impulsada por un protocolo desarrollado anteriormente utilizado por nuestro grupo para estudios de dieta en la enfermedad inflamatoria intestinal. Se proporcionarán vasos de recolección a los pacientes y se les indicará que recolecten una muestra la noche anterior o la mañana de su cita. Se indicará a los sujetos que guarden la muestra en el frigorífico mientras tanto. Las muestras fecales se analizarán en busca de composición microbiana, señales inflamatorias y calprotectina fecal.

La composición de la comunidad microbiana de las muestras fecales se evaluará mediante análisis del gen 16S rRNA. El ADN se extraerá de los homogeneizados fecales combinando la lisis celular enzimática y mecánica con el QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, EE. UU.). La composición de la microbiota fecal se caracterizará mediante la secuenciación de etiquetas de ARNr 16S utilizando la tecnología MiSeq Illumina (extremo de par), dirigida a las regiones V3-V5. Las lecturas con control de calidad se analizarán utilizando 1) enfoques basados ​​en taxonomía como Global Alignment for Sequence Taxonomy (GAST)15 y la herramienta Ribosomal Database Project MultiClassifier y 2) algoritmos de agrupamiento no basados ​​en taxonomía para la determinación de unidades taxonómicas operativas con UPARSE tubería. Los índices de diversidad alfa (especies observadas, Shannon, Simpson) y diversidad β (Bray-Curtis, binario Jaccard) se calcularán en QIIME y R (paquete VEGAN). Los gráficos de ordenación para las métricas de diversidad β se generarán mediante la ordenación de escala multidimensional no paramétrica en R. Para evaluar la composición funcional del microbioma, se inferirá el contenido genético de la comunidad microbiana mediante el algoritmo PICRUSt16. PICRUSt utiliza información sobre el contenido de genes y el número de copias del gen 16S rRNA de la base de datos IMG (genomas microbianos integrados) para predecir qué genes están presentes en los organismos de las muestras experimentales. Las tablas de OTU generadas con QIIME/UPARSE se normalizarán por el número de copias del gen 16S rRNA y dichos valores normalizados se multiplicarán por la abundancia calculada de familias de genes en cada taxón durante el procedimiento de inferencia del contenido de genes realizado con PICRUSt. El resultado es una tabla de recuentos de familias de genes que es comparable a las generadas por canalizaciones de anotación de metagenomas como HUMAnN y MG-RAST y que se pueden organizar en rutas metabólicas. Finalmente, se cuantificará la contribución de cada OTU a una determinada función génica. Para identificar poblaciones microbianas y rutas metabólicas con abundancia diferenciadora en los diferentes grupos, se utilizará el algoritmo LDA (Linear Discriminant Analysis) Effect Size (LEfSe) con la interfaz en línea Galaxy (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy /raíz).

Metabolómica de orina y suero: Se recolectarán muestras de orina y sangre durante la visita a la clínica del sujeto. Las muestras de orina se obtendrán en un frasco de recolección de orina estándar que contiene azida de sodio para evitar el crecimiento bacteriano y se congelarán después de la recolección. Las muestras de sangre se recolectarán en tubos de recolección heparinizados en el momento del análisis de sangre de rutina clínicamente indicado, específicamente seis semanas antes de la operación y tres y nueve meses después de la operación. El suero se aislará por centrifugación a 2 000 g durante 10 minutos después de la recolección y se almacenará a -80 ⁰C. Las muestras de orina y suero se utilizarán para la elaboración de perfiles metabolómicos mediante espectroscopia de RMN en cada momento.

El perfil metabolómico se realizará con espectroscopia de RMN a través del Centro de innovación de metabolómica de la Universidad de Alberta. Las muestras se procesarán en un espectrómetro de RMN Varian INOVA de 600 MHz de 4 canales. Se seguirán los parámetros estándar de adquisición y procesamiento de Chenomx. El análisis de 1H-NMR utilizando el software Chenomx NMR Suite permitirá la identificación simultánea de hasta 300 moléculas pequeñas. Los espectros de RMN resultantes se someterán a análisis mediante la técnica de creación de perfiles específicos que comparan espectros con una base de datos de referencia conocida para identificar metabolitos.

Citocinas y quimiocinas inflamatorias: el suero se evaluará para medir la tasa de sedimentación de eritropoyetina (ESR) y la proteína C reactiva (CRP) como medidas de inflamación sistémica y LPS, como medida de translocación bacteriana.

Tanto las muestras de suero como las de tejido se analizarán en busca de citocinas y quimiocinas inflamatorias. Las muestras de tejido serán recolectadas por un miembro del equipo de estudio en el momento de la cirugía. Se recolectará una muestra de la mucosa del estómago para los pacientes con SG y del estómago y el yeyuno para los pacientes con RYGB, se congelará instantáneamente en la sala de operaciones con nitrógeno líquido y, posteriormente, se almacenará a -80 ⁰C. Estas muestras se extraen como parte estándar de los procedimientos. Se analizarán en busca de citoquinas inflamatorias. Los investigadores han establecido una buena relación de trabajo con el personal de quirófano y los cirujanos de nuestras ciudades en estudios anteriores que facilitarán este proceso.

La respuesta inmunitaria del huésped se evaluará en muestras mediante la expresión de proteínas de citocinas y quimiocinas utilizando la plataforma Meso Scale Discovery (MSD, Gaithersburg, Maryland, EE. UU.). El uso de esta tecnología de matriz múltiple nos proporcionará un rango dinámico y la sensibilidad para medir una gran cantidad de señales inflamatorias y homeostáticas simultáneamente en una sola muestra. Los investigadores se centrarán inicialmente en las citocinas implicadas en las vías del receptor farnesoide X, dada la aparente relación entre la cirugía bariátrica, la pérdida de peso y los ácidos biliares17. Específicamente, estas citoquinas incluyen IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, TNFα y MCP-1.

Análisis: Se utilizará un enfoque de biología de sistemas para combinar la metagenómica, la metabolómica y el perfil inmunológico múltiple para definir los cambios microbianos, metabólicos e inmunológicos combinados que ocurren después de la cirugía bariátrica. Las diferencias entre las variables continuas y el resultado se evaluarán mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Las diferencias entre las variables explicativas categóricas y el resultado se evaluarán mediante la prueba de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher cuando el tamaño de celda es <5. Las variables significativas en el nivel de p < 0,10 mediante la prueba de razón de verosimilitud de la regresión logística univariante se ingresarán en la regresión logística multivariable. Se utilizará un procedimiento de selección por pasos hacia atrás y aquellas variables con un valor p de relación de verosimilitud <0,05 se mantendrán en el modelo multivariable. QIIME (Información cuantitativa sobre ecología microbiana), MEGAN (Analizador MEtaGenome) y Metastats, se realizarán utilizando la experiencia desarrollada en CEGIIR y en colaboración con el Dr. Gane Wong, un experto en biología de sistemas.

LIMITACIONES

• Aplicabilidad de los cambios en la cirugía bariátrica a la pérdida de peso en general
• Diferenciar causa y efecto de los cambios.
• Evaluación del efecto de los cambios en la dieta después y antes de la cirugía