La microbiologia della chirurgia bariatrica

IPOTESI I ricercatori ipotizzano che la disbiosi microbica intestinale e una diminuzione della diversità contribuiscano allo sviluppo e alla perpetuazione dell'obesità. L'effetto della disbiosi è multifattoriale e include una diminuzione della funzione di barriera intestinale e la conseguente infiammazione locale e sistemica che incita la sindrome metabolica. La fisiologia intestinale alterata dopo RYGB e SG porterà a cambiamenti identificabili in specifiche popolazioni microbiche e ad un aumento della diversità. Specifici cambiamenti microbici benefici si tradurranno successivamente in perdita di peso, riduzione dell'infiammazione e un profilo metabolico normalizzato.

METODI Popolazione in studio: i pazienti saranno reclutati dalla Edmonton Adult Specialty Bariatric Clinic presso il Royal Alexandra hospital.

Dimensione del campione: ogni coorte di controlli dietetici RYGB, SG e non chirurgici avrà 30 pazienti (totale n = 90). Studi precedenti hanno incluso 15 o meno partecipanti per braccio.

Calcolo della dimensione del campione: il calcolo della dimensione del campione è stato progettato per garantire che lo studio catturi adeguatamente i cambiamenti microbici indotti dalla chirurgia. Nella letteratura precedente, un'importante specie batterica produttrice di acidi grassi a catena corta' (F. prausnitzii) l'abbondanza relativa era inferiore in un gruppo post-RYGB rispetto ai controlli non operativi (0,031 v. 0,053 σ 0,024). Con un alfa di 0,05 e un beta di 0,90, ciò richiederebbe 26 soggetti per braccio. Includendo un tasso di abbandono del 10%, questo aumenta a 30 soggetti per braccio.

Disegno dello studio: per il braccio di intervento, i soggetti saranno arruolati nel momento in cui sono programmati per l'intervento chirurgico. I campioni di feci, urina e sangue saranno raccolti in clinica 2-6 settimane prima dell'intervento. Nel periodo postoperatorio, la raccolta delle feci avverrà durante le visite cliniche programmate di tre e nove mesi. Tutti i campioni preoperatori verranno raccolti prima che i soggetti inizino un liquido preoperatorio di 2-4 settimane progettato per ridurre l'epatomegalia e facilitare gli aspetti tecnico chirurgici della procedura.

I controlli non chirurgici saranno pazienti trattati con interventi dietetici e comportamentali per la perdita di peso. Ciò include modifiche della dieta e dell'attività ed esclude la sostituzione del pasto o gli interventi farmacologici. Per questa coorte, i soggetti riceveranno un campionamento iniziale (fecale, urina, sangue) prima di iniziare gli interventi di perdita di peso. Ulteriori campionamenti avverranno quindi a tre mesi e nove mesi dopo l'inizio dell'intervento.

L'elaborazione dei campioni e l'analisi immunitaria si svolgeranno presso il Centro di eccellenza per la ricerca sull'infiammazione e l'immunità gastrointestinale (CEGIIR) dell'Università di Alberta. Il sequenziamento sarà effettuato dall'Applied Genomics Center all'interno del CEGIIR e la metabolomica sarà effettuata presso il Metabolomic Innovation Center dell'Università di Alberta come compenso per il servizio.

Analisi microbica fecale: la raccolta di campioni fecali sarà guidata da un protocollo precedentemente sviluppato utilizzato dal nostro gruppo per studi dietetici nella malattia infiammatoria intestinale. Ai pazienti verranno fornite tazze di raccolta e verrà loro chiesto di raccogliere un campione la sera prima o la mattina dell'appuntamento. I soggetti verranno istruiti a conservare il campione in frigorifero nel frattempo. I campioni fecali saranno analizzati per composizione microbica, segnali infiammatori e calprotectina fecale.

La composizione della comunità microbica dei campioni fecali sarà valutata mediante analisi del gene 16S rRNA. Il DNA sarà estratto dagli omogenati fecali combinando la lisi cellulare enzimatica e meccanica con il kit QIAamp DNA Stool Mini (Qiagen, Valencia, CA, USA). La composizione del microbiota fecale sarà caratterizzata dal sequenziamento del tag 16S rRNA utilizzando la tecnologia MiSeq Illumina (pair-end), mirando alle regioni V3-V5. Le letture controllate dalla qualità saranno analizzate utilizzando 1) approcci basati sulla tassonomia come Global Alignment for Sequence Taxonomy (GAST)15 e lo strumento Ribosomal Database Project MultiClassifier e 2) algoritmi di clustering non basati sulla tassonomia per la determinazione dell'unità tassonomica operativa con UPARSE tubatura. Gli indici di diversità alfa (specie osservate, Shannon, Simpson) e di diversità β (Bray-Curtis, Jaccard binario) saranno calcolati in QIIME e R (pacchetto VEGAN). I grafici di ordinazione per le metriche di β-diversità saranno generati mediante ordinazione di scala multidimensionale non parametrica in R. Al fine di valutare la composizione funzionale del microbioma, il contenuto genico della comunità microbica sarà dedotto utilizzando l'algoritmo PICRUSt16. PICRUSt utilizza le informazioni sul contenuto genico e il numero di copie del gene rRNA 16S dal database IMG (integrated microbial genomas) per prevedere quali geni sono presenti negli organismi dei campioni sperimentali. Le tabelle OTUs generate con QIIME/UPARSE saranno normalizzate dal numero di copie del gene rRNA 16S e tali valori normalizzati saranno moltiplicati per l'abbondanza calcolata delle famiglie geniche in ciascun taxon durante la procedura di inferenza del contenuto genico eseguita con PICRUSt. Il risultato è una tabella dei conteggi delle famiglie geniche paragonabile a quella generata dalle pipeline di annotazione del metagenoma come HUMAnN e MG-RAST e che può essere organizzata in percorsi metabolici. Infine, verrà quantificato il contributo di ciascuna OTU a una data funzione genica. Per identificare le popolazioni microbiche e le vie metaboliche con abbondanza differenziante nei diversi gruppi, verrà utilizzato l'algoritmo LDA (Linear Discriminant Analysis) Effect Size (LEfSe) con l'interfaccia online Galaxy (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy /radice).

Metabolica delle urine e del siero: durante la visita clinica del soggetto verranno raccolti campioni di urina e sangue. I campioni di urina saranno ottenuti in un barattolo standard per la raccolta delle urine contenente sodio azide per prevenire la crescita batterica e congelati dopo la raccolta. I campioni di sangue verranno raccolti in provette di raccolta eparinizzate al momento dell'analisi del sangue clinicamente indicata di routine, in particolare sei settimane prima dell'intervento e tre e nove mesi dopo l'intervento. Il siero sarà isolato mediante centrifugazione a 2 000 g per 10 minuti dopo la raccolta e conservato a -80⁰C. I campioni di urina e siero verranno utilizzati per la profilazione metabolomica utilizzando la spettroscopia NMR in ogni punto temporale.

La profilazione metabolomica sarà effettuata con spettroscopia NMR attraverso il Metabolomics Innovation Center presso l'Università di Alberta. I campioni verranno analizzati su uno spettrometro Varian INOVA 600 MHz NMR a 4 canali. Saranno seguiti i parametri standard di acquisizione ed elaborazione di Chenomx. 1 L'analisi H-NMR utilizzando il software Chenomx NMR Suite consentirà l'identificazione simultanea di un massimo di 300 piccole molecole. Gli spettri NMR risultanti saranno sottoposti ad analisi utilizzando la tecnica del profiling mirato confrontando gli spettri con un database di riferimento noto per identificare i metaboliti.

Citochine e chemochine infiammatorie: il siero sarà valutato per la misurazione della velocità di sedimentazione dell'eritropoietina (VES) e della proteina C-reattiva (CRP) come misurazioni dell'infiammazione sistemica e LPS, come misurazione della traslocazione batterica.

Sia i campioni di siero che di tessuto saranno analizzati per citochine e chemochine infiammatorie. I campioni di tessuto saranno raccolti da un membro del team di studio al momento dell'intervento chirurgico. Verrà prelevato un campione di mucosa dallo stomaco per i pazienti con SG e sia dallo stomaco che dal digiuno per i pazienti con RYGB, congelato in sala operatoria utilizzando azoto liquido e successivamente conservato a -80⁰C. Questi campioni vengono rimossi come parte standard delle procedure. Saranno analizzati per le citochine infiammatorie. Gli investigatori hanno stabilito un buon rapporto di lavoro con il personale della sala operatoria e i chirurghi nelle nostre città in studi precedenti che faciliteranno questo processo.

La risposta immunitaria dell'ospite sarà valutata nei campioni mediante espressione proteica di citochine e chemochine utilizzando la piattaforma Meso Scale Discovery (MSD, Gaithersburg, Maryland USA). L'utilizzo di questa tecnologia multi-array ci fornirà una gamma dinamica e la sensibilità per misurare simultaneamente un gran numero di segnali infiammatori e omeostatici in un singolo campione. I ricercatori si concentreranno inizialmente sulle citochine coinvolte nelle vie del recettore Farnesoid X, data l'apparente relazione tra chirurgia bariatrica, perdita di peso e acidi biliari17. Nello specifico, queste citochine includono IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, TNFα e MCP-1.

Analisi: verrà utilizzato un approccio di biologia dei sistemi per combinare la metagenomica, la metabolomica e la profilazione immunitaria multiplex per definire i cambiamenti combinati microbici, metabolici e immunologici che si verificano dopo la chirurgia bariatrica. Le differenze tra le variabili continue e l'esito saranno valutate mediante il test della somma dei ranghi di Wilcoxon. Le differenze tra le variabili esplicative categoriche e il risultato saranno valutate mediante il test del chi-quadrato o il test esatto di Fisher quando la dimensione della cella è <5. Le variabili significative al livello p <0,10 mediante test del rapporto di verosimiglianza dalla regressione logistica univariata verranno inserite nella regressione logistica multivariata. Verrà utilizzata una procedura di selezione stepwise all'indietro e quelle variabili con un rapporto di verosimiglianza p-value <0.05 saranno mantenute nel modello multivariabile. QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology), MEGAN (MEtaGenome Analyzer) e Metastats, saranno eseguiti utilizzando le competenze sviluppate presso il CEGIIR e in collaborazione con il Dr. Gane Wong, un esperto di biologia dei sistemi.

LIMITAZIONI

• Applicabilità dei cambiamenti nella chirurgia bariatrica alla perdita di peso in generale
• Differenziare causa ed effetto dei cambiamenti
• Valutazione dell'effetto dei cambiamenti nella dieta dopo e prima dell'intervento chirurgico