肥満手術の微生物学

仮説 研究者らは、腸内微生物異常症と多様性の減少が肥満の発症と永続化に寄与していると仮説を立てています。 腸内細菌叢症の影響は多因子的であり、腸のバリア機能の低下と、結果としてメタボリック シンドロームを誘発する局所および全身の炎症が含まれます。 RYGB と SG に続く腸の生理機能の変化は、特定の微生物集団の識別可能な変化と多様性の増加につながります。 特定の有益な微生物の変化は、その後、体重減少、炎症の軽減、および代謝プロファイルの正常化をもたらします。

方法 研究集団: 患者は、ロイヤル アレクサンドラ病院のエドモントン成人専門肥満クリニックから募集されます。

サンプルサイズ: RYGB、SG、および非外科的食事管理の各コホートには、30 人の患者が含まれます (合計 n = 90)。 以前の研究では、アームあたり 15 人以下の参加者が含まれていました。

サンプルサイズの計算: サンプルサイズの計算は、研究が手術によって誘発された微生物の変化を適切に捉えることを保証するように設計されました。 以前の文献では、重要な短鎖脂肪酸を産生する細菌種が 1 つあります」(F. prausnitzii) 相対存在量は、非手術対照と比較して、RYGB 後の群で低かった (0.031 対 0.053 σ 0.024)。 アルファが 0.05、ベータが 0.90 の場合、1 アームあたり 26 人の被験者が必要になります。 ドロップアウト率 10% を含めると、これは 1 アームあたり 30 人の被験者に増加します。

研究デザイン：介入アームの場合、被験者は手術が予定されている時点で登録されます。 糞便、尿、および血液サンプルは、手術の 2 ～ 6 週間前に診療所で収集されます。 術後の期間では、予定された 3 か月および 9 か月の診療所で糞便の収集が行われます。 すべての術前サンプルは、肝腫大を軽減し、手順の技術的な外科的側面を容易にするように設計された2〜4週間の術前液体を被験者が開始する前に収集されます。

非外科的対照は、減量のために食事および行動介入で治療されている患者です。 これには食事と活動の変更が含まれ、食事の置き換えや薬理学的介入は除外されます。 このコホートでは、被験者は減量介入を開始する前に、最初のサンプリング（糞便、尿、血液）を採取します。 その後、介入開始から 3 か月後と 9 か月後に、さらにサンプリングを行います。

サンプル処理と免疫分析は、アルバータ大学の消化管炎症および免疫研究センター (CEGIIR) で行われます。 配列決定はCEGIIR内のApplied Genomics Centerによって実施され、メタボロミクスはサービス料金としてアルバータ大学のメタボロミクス・イノベーション・センターで実施されます。

糞便微生物分析: 糞便サンプルの収集は、炎症性腸疾患の食事研究のために私たちのグループが使用する以前に開発されたプロトコルによって駆動されます。 採取カップが患者に提供され、予約の前夜または朝に検体を採取するように指示されます。 対象者は、その間標本を冷蔵庫に保管するように指示されます。 糞便サンプルは、微生物組成、炎症シグナル、および糞便カルプロテクチンについて分析されます。

糞便サンプルの微生物群集組成は、16S rRNA 遺伝子解析を使用して評価されます。 酵素的および機械的細胞溶解をQIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen、Valencia、CA、USA）と組み合わせて、糞便ホモジネートからDNAを抽出します。 糞便微生物叢の組成は、V3-V5 領域をターゲットとする MiSeq Illumina テクノロジー (ペアエンド) を使用した 16S rRNA タグ シーケンスによって特徴付けられます。 品質管理された読み取りは、1) Global Alignment for Sequence Taxonomy (GAST)15 や Ribosomal Database Project MultiClassifier ツールなどの分類ベースのアプローチ、および 2) UPARSE を使用した運用分類単位決定のための非分類ベースのクラスタリング アルゴリズムを使用して分析されます。パイプライン。 アルファ多様性 (観測された種、Shannon、Simpson) および β 多様性指数 (Bray-Curtis、binary Jaccard) は、QIIME および R (VEGAN パッケージ) で計算されます。 β 多様性メトリックの順序付けプロットは、R のノンパラメトリック多次元スケーリング順序付けによって生成されます。マイクロバイオームの機能的構成を評価するために、PICRUSt アルゴリズムを使用して微生物群集の遺伝子内容を推測します16。 PICRUSt は、IMG (統合微生物ゲノム) データベースからの遺伝子内容と 16S rRNA 遺伝子コピー数に関する情報を使用して、実験サンプルの生物にどの遺伝子が存在するかを予測します。 QIIME/UPARSE で生成された OTU テーブルは、16S rRNA 遺伝子のコピー数によって正規化され、そのような正規化された値は、PICRUSt で実行される遺伝子コンテンツ推論手順中に、各分類群の遺伝子ファミリーの計算された存在量で乗算されます。 結果は、HUMAnN や MG-RAST などのメタゲノム アノテーション パイプラインによって生成されたものに匹敵し、代謝経路に編成できる遺伝子ファミリー数の表です。 最後に、特定の遺伝子機能に対する各 OTU の寄与が定量化されます。 さまざまなグループの存在量を区別して微生物集団と代謝経路を特定するために、オンライン インターフェイス Galaxy (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy) で LDA (線形判別分析) Effect Size (LEfSe) アルゴリズムが使用されます。 /根）。

尿および血清のメタボロミクス: 尿および血液サンプルは、被験者の診療所訪問中に収集されます。 尿サンプルは、細菌の増殖を防ぐためにアジ化ナトリウムを含む標準的な尿収集ジャーで得られ、収集後に凍結されます。 血液サンプルは、定期的な臨床的に指示された血液検査の時点で、特に術前 6 週間、術後 3 か月および 9 か月に、ヘパリン処理された採血管に採取されます。 採取後、血清を 2,000 g で 10 分間遠心分離して分離し、-80⁰C で保存します。 尿および血清サンプルは、各時点で NMR 分光法を使用したメタボロミクス プロファイリングに使用されます。

メタボロミクス プロファイリングは、アルバータ大学のメタボロミクス イノベーション センターを通じて NMR 分光法で行われます。 サンプルは、4 チャンネル Varian INOVA 600 MHz NMR 分光計で実行されます。 標準の Chenomx 取得および処理パラメーターに従います。 Chenomx NMR Suite ソフトウェアを使用した 1 H-NMR 分析では、最大 300 の小分子を同時に同定できます。 得られた NMR スペクトルは、スペクトルを既知の参照データベースと比較して代謝物を特定するターゲット プロファイリングの手法を使用して分析されます。

炎症性サイトカインおよびケモカイン：血清は、全身性炎症の測定としてエリスロポエチン沈降速度（ESR）およびC反応性タンパク質（CRP）の測定、および細菌移行の測定としてLPSの測定について評価されます。

血清および組織サンプルの両方を、炎症性サイトカインおよびケモカインについて分析します。 組織サンプルは、手術時に研究チームのメンバーによって収集されます。 SG 患者の場合は胃から、RYGB 患者の場合は胃と空腸の両方から粘膜標本を採取し、液体窒素を使用して手術室で急速冷凍し、その後 -80℃で保存します。 これらの標本は、手順の標準的な部分として削除されます。 それらは、炎症性サイトカインについて分析されます。 調査官は、このプロセスを促進する以前の研究で、手術室のスタッフや都市周辺の外科医と良好な協力関係を確立しています。

Meso Scale Discoveryプラットフォーム（MSD、Gaithersburg、Maryland USA）を使用して、サイトカインおよびケモカインのタンパク質発現によってサンプルの宿主免疫応答を評価します。 このマルチ アレイ技術を使用すると、1 つのサンプルで多数の炎症および恒常性シグナルを同時に測定するためのダイナミック レンジと感度が得られます。 肥満手術、減量、および胆汁酸との間に明らかな関係があることを考えると、研究者はまず、ファルネソイド X 受容体経路に関与するサイトカインに焦点を当てます 17。 具体的には、これらのサイトカインには、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、TNFα、および MCP-1 が含まれます。

分析: システム生物学のアプローチを使用して、メタゲノミクス、メタボロミクス、および多重免疫プロファイリングを組み合わせて、肥満手術後に発生する微生物、代謝、および免疫学的変化を組み合わせて定義します。 連続変数と結果の違いは、ウィルコクソンの順位和検定によって評価されます。 カテゴリ説明変数と結果の違いは、カイ 2 乗検定、またはセル サイズが 5 未満の場合はフィッシャーの正確確率検定によって評価されます。 単変量ロジスティック回帰からの尤度比検定による p < 0.10 レベルで有意な変数は、多変数ロジスティック回帰に入力されます。 後方段階的選択手順が利用され、尤度比p値が0.05未満の変数が多変数モデルで維持されます。 QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology)、MEGAN (MEtaGenome Analyzer)、および Metastats は、CEGIIR で開発された専門知識を使用し、システム生物学の専門家である Gane Wong 博士と協力して実施されます。

制限事項

• 肥満外科手術における変更の一般的な減量への適用可能性
• 変化の原因と結果の区別
• 手術前後の食事変更の影響の評価