La microbiologie de la chirurgie bariatrique

HYPOTHÈSE Les chercheurs émettent l'hypothèse que la dysbiose microbienne intestinale et une diminution de la diversité contribuent au développement et à la perpétuation de l'obésité. L'effet de la dysbiose est multifactoriel et comprend une diminution de la fonction de barrière intestinale et une inflammation locale et systémique résultante qui incite au syndrome métabolique. La physiologie intestinale altérée après RYGB et SG entraînera des changements identifiables dans des populations microbiennes spécifiques et une augmentation de la diversité. Des changements microbiens bénéfiques spécifiques entraîneront par la suite une perte de poids, une réduction de l'inflammation et un profil métabolique normalisé.

MÉTHODES Population à l'étude : Les patients seront recrutés à la clinique bariatrique spécialisée pour adultes d'Edmonton à l'hôpital Royal Alexandra.

Taille de l'échantillon : Chaque cohorte de RYGB, SG et contrôles alimentaires non chirurgicaux comptera 30 patients (total n = 90). Des études antérieures ont inclus 15 participants ou moins par bras.

Calcul de la taille de l'échantillon : Le calcul de la taille de l'échantillon a été conçu pour s'assurer que l'étude saisirait adéquatement les changements microbiens induits par la chirurgie. Dans la littérature antérieure, une importante espèce bactérienne productrice d'acides gras à chaîne courte (F. prausnitzii) l'abondance relative était plus faible dans un groupe post-RYGB par rapport aux témoins non opératoires (0,031 contre 0,053 σ 0,024). Avec un alpha de 0,05 et un bêta de 0,90, cela nécessiterait 26 sujets par bras. En incluant un taux d'abandon de 10 %, cela passe à 30 sujets par bras.

Conception de l'étude : Pour le groupe d'intervention, les sujets seront inscrits au moment où ils sont programmés pour la chirurgie. Des échantillons de matières fécales, d'urine et de sang seront prélevés à la clinique 2 à 6 semaines avant la chirurgie. Dans la période postopératoire, la collecte des matières fécales aura lieu lors des visites cliniques prévues de trois et neuf mois. Tous les échantillons préopératoires seront prélevés avant que les sujets ne commencent un liquide préopératoire de 2 à 4 semaines conçu pour réduire l'hépatomégalie et faciliter les aspects chirurgicaux techniques de la procédure.

Les témoins non chirurgicaux seront des patients traités par des interventions diététiques et comportementales pour perdre du poids. Cela inclut les modifications du régime alimentaire et des activités et exclut les substituts de repas ou les interventions pharmacologiques. Pour cette cohorte, les sujets subiront un prélèvement initial (selles, urine, sang) avant de commencer les interventions de perte de poids. Un autre échantillonnage aura alors lieu trois mois et neuf mois après le début de l'intervention.

Le traitement des échantillons et l'analyse immunitaire auront lieu au Centre d'excellence pour la recherche sur l'inflammation et l'immunité gastro-intestinales (CEGIIR) de l'Université de l'Alberta. Le séquençage sera effectué par le Centre de génomique appliquée du CEGIIR et la métabolomique sera effectuée au Centre d'innovation métabolomique de l'Université de l'Alberta moyennant des frais de service.

Analyse microbienne fécale : la collecte d'échantillons fécaux sera guidée par un protocole développé précédemment utilisé par notre groupe pour les études sur l'alimentation dans les maladies inflammatoires de l'intestin. Des gobelets de prélèvement seront fournis aux patients et ils seront invités à prélever un échantillon la veille ou le matin de leur rendez-vous. Les sujets seront invités à conserver le spécimen au réfrigérateur dans l'intervalle. Des échantillons fécaux seront analysés pour la composition microbienne, les signaux inflammatoires et la calprotectine fécale.

La composition de la communauté microbienne des échantillons fécaux sera évaluée à l'aide d'analyses génétiques de l'ARNr 16S. L'ADN sera extrait des homogénats fécaux en combinant la lyse cellulaire enzymatique et mécanique avec le kit QIAamp DNA Stool Mini (Qiagen, Valencia, CA, USA). La composition du microbiote fécal sera caractérisée par le séquençage d'étiquettes d'ARNr 16S à l'aide de la technologie MiSeq Illumina (pair-end), ciblant les régions V3-V5. Les lectures à qualité contrôlée seront analysées à l'aide 1) d'approches taxonomiques telles que l'alignement global pour la taxonomie des séquences (GAST)15 et l'outil Ribosomal Database Project MultiClassifier et 2) d'algorithmes de regroupement non taxonomiques pour la détermination de l'unité taxonomique opérationnelle avec l'UPARSE pipeline. Les indices de diversité alpha (espèces observées, Shannon, Simpson) et de diversité β (Bray-Curtis, binaire Jaccard) seront calculés dans QIIME et R (package VEGAN). Des parcelles d'ordination pour les métriques de diversité β seront générées par une ordination de mise à l'échelle multidimensionnelle non paramétrique dans R. Afin d'évaluer la composition fonctionnelle du microbiome, le contenu génétique de la communauté microbienne sera déduit à l'aide de l'algorithme PICRUSt16. PICRUSt utilise des informations sur le contenu des gènes et le nombre de copies du gène de l'ARNr 16S de la base de données IMG (génomes microbiens intégrés) pour prédire quels gènes sont présents dans les organismes des échantillons expérimentaux. Les tables d'OTU générées avec QIIME/UPARSE seront normalisées par le nombre de copies de gènes d'ARNr 16S et ces valeurs normalisées sont multipliées par l'abondance calculée des familles de gènes dans chaque taxon au cours de la procédure d'inférence du contenu génétique effectuée avec PICRUSt. Le résultat est un tableau de comptes de familles de gènes comparable à ceux générés par les pipelines d'annotation de métagénomes tels que HUMAnN et MG-RAST et qui peut être organisé en voies métaboliques. Enfin, la contribution de chaque OTU à une fonction génique donnée sera quantifiée. Pour identifier les populations microbiennes et les voies métaboliques avec une abondance différenciante dans les différents groupes, l'algorithme LDA (Linear Discriminant Analysis) Effect Size (LEfSe) sera utilisé avec l'interface en ligne Galaxy (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy /racine).

Métabolomique urinaire et sérique : des échantillons d'urine et de sang seront prélevés lors de la visite à la clinique du sujet. Les échantillons d'urine seront obtenus dans un pot de collecte d'urine standard contenant de l'azide de sodium pour empêcher la croissance bactérienne, et congelés après la collecte. Des échantillons de sang seront prélevés dans des tubes de prélèvement héparinés au moment des analyses sanguines de routine cliniquement indiquées, en particulier six semaines avant l'opération et trois et neuf mois après l'opération. Le sérum sera isolé par centrifugation à 2 000 g pendant 10 minutes après le prélèvement et conservé à -80⁰C. Des échantillons d'urine et de sérum seront utilisés pour le profilage métabolomique à l'aide de la spectroscopie RMN à chaque instant.

Le profilage métabolomique sera effectué par spectroscopie RMN par l'intermédiaire du Metabolomics Innovation Centre de l'Université de l'Alberta. Les échantillons seront analysés sur un spectromètre RMN Varian INOVA 600 MHz à 4 canaux. Les paramètres d'acquisition et de traitement standard de Chenomx seront suivis. L'analyse 1H-RMN à l'aide du logiciel Chenomx NMR Suite permettra l'identification simultanée de jusqu'à 300 petites molécules. Les spectres RMN résultants seront soumis à une analyse utilisant la technique de profilage ciblé comparant les spectres à une base de données de référence connue pour identifier les métabolites.

Cytokines et chimiokines inflammatoires : le sérum sera évalué pour mesurer la vitesse de sédimentation de l'érythropoïétine (ESR) et la protéine C-réactive (CRP) comme mesure de l'inflammation systémique, et le LPS, comme mesure de la translocation bactérienne.

Les échantillons de sérum et de tissus seront analysés pour les cytokines et les chimiokines inflammatoires. Des échantillons de tissus seront prélevés par un membre de l'équipe d'étude au moment de la chirurgie. Un échantillon de muqueuse de l'estomac sera prélevé pour les patients SG et de l'estomac et du jéjunum pour les patients RYGB, congelé instantanément dans la salle d'opération à l'aide d'azote liquide, puis stocké à -80⁰C. Ces spécimens sont retirés dans le cadre des procédures standard. Ils seront analysés pour les cytokines inflammatoires. Les enquêteurs ont établi de bonnes relations de travail avec le personnel des salles d'opération et les chirurgiens de nos villes lors d'études précédentes, ce qui facilitera ce processus.

La réponse immunitaire de l'hôte sera évaluée dans des échantillons par l'expression protéique de cytokines et de chimiokines à l'aide de la plateforme Meso Scale Discovery (MSD, Gaithersburg, Maryland USA). L'utilisation de cette technologie multi-puces nous fournira une gamme dynamique et la sensibilité pour mesurer simultanément un grand nombre de signaux inflammatoires et homéostatiques dans un seul échantillon. Les chercheurs se concentreront initialement sur les cytokines impliquées dans les voies des récepteurs Farnesoid X, compte tenu de la relation apparente entre la chirurgie bariatrique, la perte de poids et les acides biliaires17. Plus précisément, ces cytokines comprennent IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, TNFα et MCP-1.

Analyse : Une approche de biologie des systèmes sera utilisée pour combiner la métagénomique, la métabolomique et le profilage immunitaire multiplex afin de définir les changements microbiens, métaboliques et immunologiques combinés qui se produisent après la chirurgie bariatrique. Les différences entre les variables continues et les résultats seront évaluées par le test de somme des rangs de Wilcoxon. Les différences entre les variables explicatives catégorielles et le résultat seront évaluées par le test du chi carré ou le test exact de Fisher lorsque la taille de la cellule est < 5. Les variables significatives au niveau p < 0,10 par le test du rapport de vraisemblance de la régression logistique univariée seront entrées dans la régression logistique multivariée. Une procédure de sélection pas à pas vers l'arrière sera utilisée et les variables avec une valeur p de rapport de vraisemblance <0,05 seront maintenues dans le modèle multivariable. QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology), MEGAN (MEtaGenome Analyzer) et Metastats, seront réalisés en utilisant l'expertise développée au CEGIIR et en collaboration avec le Dr Gane Wong, un expert en biologie des systèmes.

LIMITES

• Applicabilité des modifications de la chirurgie bariatrique à la perte de poids en général
• Différencier la cause et l'effet des changements
• Évaluation de l'effet des changements alimentaires après et avant la chirurgie