Bariatrisk kirurgis mikrobiologi

HYPOTES Utredarna antar att tarmmikrobiell dysbios och en minskning av mångfalden bidrar till utvecklingen och vidmakthållandet av fetma. Effekten av dysbios är multifaktoriell och inkluderar en minskning av tarmbarriärfunktionen och resulterande lokal och systemisk inflammation som framkallar det metabola syndromet. Den förändrade tarmens fysiologi efter RYGB och SG kommer att leda till identifierbara förändringar i specifika mikrobiella populationer och en ökning av mångfalden. Specifika fördelaktiga mikrobiella förändringar kommer därefter att resultera i viktminskning, minskad inflammation och en normaliserad metabolisk profil.

METODER Studiepopulation: Patienter kommer att rekryteras från Edmonton Adult Specialty Bariatric Clinic vid Royal Alexandra sjukhuset.

Provstorlek: Varje kohort av RYGB, SG och icke-kirurgiska dietkontroller kommer att ha 30 patienter (totalt n = 90). Tidigare studier har inkluderat 15 eller färre deltagare per arm.

Beräkning av provstorlek: Beräkning av provstorlek utformades för att säkerställa att studien på ett adekvat sätt skulle fånga mikrobiella förändringar inducerade av kirurgi. I tidigare litteratur, en viktig kortkedjig fettsyraproducerande bakterieart" (F. prausnitzii) var den relativa mängden lägre i en post-RYGB-grupp jämfört med icke-operativa kontroller (0,031 mot 0,053 σ 0,024). Med ett alfa på 0,05 och ett beta på 0,90 skulle detta kräva 26 försökspersoner per arm. Inklusive ett avhopp på 10 % ökar detta till 30 försökspersoner per arm.

Studiedesign: För interventionsarmen kommer försökspersoner att skrivas in vid den tidpunkt då de är schemalagda för operation. Avförings-, urin- och blodprover kommer att samlas in på kliniken 2-6 veckor före operationen. Under den postoperativa perioden kommer fekal uppsamling att ske vid schemalagda tre- och niomånadersbesök på kliniken. Alla preoperativa prover kommer att samlas in innan försökspersoner påbörjar en 2-4 veckors preoperativ vätska utformad för att minska hepatomegali och underlätta de tekniska kirurgiska aspekterna av proceduren.

Icke-kirurgiska kontroller kommer att vara patienter som behandlas med diet- och beteendeinsatser för viktminskning. Detta inkluderar kost- och aktivitetsförändringar och utesluter måltidsersättning eller farmakologiska ingrepp. För denna kohort kommer försökspersonerna att få en första provtagning (avföring, urin, blod) innan de påbörjar viktminskningsinterventioner. Ytterligare provtagning kommer sedan att ske tre månader och nio månader efter påbörjad intervention.

Provbearbetning och immunanalys kommer att äga rum vid Center of Excellence for Gastrointestinal Inflammation and Immunity Research (CEGIIR) vid University of Alberta. Sekvensering kommer att utföras av Applied Genomics Centre inom CEGIIR och metabolomics kommer att göras vid Metabolomic Innovation Center vid University of Alberta som en avgift för service.

Fekal mikrobiell analys: Avföringsprovtagning kommer att drivas av ett tidigare utvecklat protokoll som används av vår grupp för dietstudier vid inflammatorisk tarmsjukdom. Uppsamlingsbägare kommer att ges till patienterna och de kommer att instrueras att ta ett prov kvällen före eller morgonen efter deras möte. Försökspersonerna kommer att instrueras att förvara provet i kylen under tiden. Fekala prover kommer att analyseras för mikrobiell sammansättning, inflammatoriska signaler och fekalt kalprotektin.

Den mikrobiella gemenskapssammansättningen av fekala prover kommer att bedömas med hjälp av 16S rRNA-genanalyser. DNA kommer att extraheras från de fekala homogenaten som kombinerar enzymatisk och mekanisk cellys med QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Fekal mikrobiota-sammansättning kommer att kännetecknas av 16S rRNA-tag-sekvensering med hjälp av MiSeq Illumina-teknologin (pair-end), riktad mot V3-V5-regionerna. Kvalitetskontrollerade avläsningar kommer att analyseras med 1) taxonomiska baserade tillvägagångssätt som Global Alignment for Sequence Taxonomy (GAST)15 och Ribosomal Database Project MultiClassifier-verktyget och 2) icke-taxonomiska baserade klustringsalgoritmer för bestämning av operationell taxonomisk enhet med UPARSE rörledning. Alfa-mångfald (observerade arter, Shannon, Simpson) och β-diversitetsindex (Bray-Curtis, binärt Jaccard) kommer att beräknas i QIIME och R (VEGAN-paket). Ordinationsdiagram för β-diversitetsmått kommer att genereras av icke-parametrisk multidimensionell skalningsordination i R. För att bedöma den funktionella sammansättningen av mikrobiomet kommer geninnehållet i den mikrobiella gemenskapen att härledas med hjälp av PICRUST-algoritmen16. PICRUST använder information om geninnehåll och 16S rRNA-genkopienummer från IMG-databasen (integrerade mikrobiella genom) för att förutsäga vilka gener som finns i organismerna i experimentproverna. OTUs-tabeller som genereras med QIIME/UPARSE kommer att normaliseras med 16S rRNA-genkopiantal och sådana normaliserade värden multipliceras med den beräknade mängden genfamiljer i varje taxon under inferensproceduren för geninnehåll som utförs med PICRUST. Resultatet är en tabell över genfamiljsantal som är jämförbar med de som genereras av metagenomannoteringspipelines som HUManN och MG-RAST och som kan organiseras i metaboliska vägar. Slutligen kommer bidraget från varje OTU till en given genfunktion att kvantifieras. För att identifiera mikrobiella populationer och metabola vägar med differentierande överflöd i de olika grupperna, kommer LDA (Linear Discriminant Analysis) Effect Size (LEfSe) algoritm att användas med onlinegränssnittet Galaxy (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy) /rot).

Urin- och serummetabolomik: Urin- och blodprover kommer att samlas in under försökspersonens klinikbesök. Urinprov kommer att tas i en standardurinsamlingsburk innehållande natriumazid för att förhindra bakterietillväxt, och frysas efter uppsamling. Blodprover kommer att samlas in i hepariniserade provtagningsrör vid tidpunkten för rutinmässigt kliniskt indikerade blodprov, närmare bestämt sex veckor före operationen och tre och nio månader efter operationen. Serum kommer att isoleras genom centrifugering vid 2 000 g i 10 minuter efter uppsamling och förvaras vid -80°C. Urin- och serumprover kommer att användas för metabolomisk profilering med hjälp av NMR-spektroskopi vid varje tidpunkt.

Metabolomisk profilering kommer att göras med NMR-spektroskopi genom Metabolomics Innovation Center vid University of Alberta. Proverna kommer att köras på en 4-kanals Varian INOVA 600 MHz NMR-spektrometer. Standard Chenomx förvärv och bearbetningsparametrar kommer att följas. 1H-NMR-analys med programvaran Chenomx NMR Suite möjliggör samtidig identifiering av upp till 300 små molekyler. De resulterande NMR-spektra kommer att utsättas för analys med hjälp av tekniken för målinriktad profilering som jämför spektra med en känd referensdatabas för att identifiera metaboliter.

Inflammatoriska cytokiner och kemokiner: Serum kommer att utvärderas för mätning av erytropoietinsedimentationshastighet (ESR) och C-reaktivt protein (CRP) som mätningar av systemisk inflammation, och LPS, som ett mått på bakteriell translokation.

Både serum- och vävnadsprover kommer att analyseras för inflammatoriska cytokiner och kemokiner. Vävnadsprover kommer att samlas in av en medlem av studieteamet vid tidpunkten för operationen. Ett slemhinneprov från magsäcken kommer att tas för SG-patienter och från både magsäcken och jejunum för RYGB-patienter, snabbfryst i operationssalen med flytande kväve och därefter förvaras vid -80⁰C. Dessa prover tas bort som en standarddel av procedurerna. De kommer att analyseras för inflammatoriska cytokiner. Utredarna har etablerat ett gott samarbete med operationspersonal och kirurger runt om i våra städer i tidigare studier som kommer att underlätta denna process.

Värdens immunsvar kommer att bedömas i prover genom proteinuttryck av cytokiner och kemokiner med hjälp av Meso Scale Discovery-plattformen (MSD, Gaithersburg, Maryland, USA). Att använda denna multi-array-teknik kommer att ge oss ett dynamiskt omfång och känsligheten för att mäta ett stort antal inflammatoriska och homeostatiska signaler samtidigt i ett enda prov. Utredarna kommer initialt att fokusera på cytokiner involverade i Farnesoid X-receptorvägarna, med tanke på det uppenbara sambandet mellan bariatrisk kirurgi, viktminskning och gallsyror17. Specifikt inkluderar dessa cytokiner IL-lp, IL-6, IL-8, IL-12, TNFa och MCP-1.

Analys: Ett systembiologiskt tillvägagångssätt kommer att användas för att kombinera metagenomik, metabolomik och multiplex immunprofilering för att definiera de kombinerade mikrobiella, metabola och immunologiska förändringarna som inträffar efter bariatrisk kirurgi. Skillnader mellan kontinuerliga variabler och utfall kommer att bedömas med Wilcoxon ranksummetest. Skillnader mellan kategoriska förklarande variabler och utfallet kommer att bedömas med chi-kvadrattestet, eller Fishers exakta test när cellstorleken är <5. Variabler som är signifikanta på nivån p < 0,10 genom testning av sannolikhetskvoten från univariat logistisk regression kommer att föras in i multivariabel logistisk regression. En stegvis urvalsprocedur bakåt kommer att användas och de variabler med ett sannolikhetsförhållande p-värde <0,05 kommer att bibehållas i den multivariabla modellen. QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology), MEGAN (MEtaGenome Analyzer) och Metastats kommer att utföras med hjälp av den expertis som utvecklats vid CEGIIR och i samarbete med Dr. Gane Wong, en systembiologiexpert.

BEGRÄNSNINGAR

• Tillämpligheten av förändringar i bariatrisk kirurgi för viktminskning i allmänhet
• Differentiering av orsak och verkan av förändringar
• Bedömning av effekt av kostförändringar efter och före operation