Die Mikrobiologie der bariatrischen Chirurgie

HYPOTHESE Die Forscher stellen die Hypothese auf, dass intestinale mikrobielle Dysbiose und eine Abnahme der Diversität zur Entwicklung und Aufrechterhaltung von Fettleibigkeit beitragen. Die Wirkung der Dysbiose ist multifaktoriell und umfasst eine Abnahme der intestinalen Barrierefunktion und eine daraus resultierende lokale und systemische Entzündung, die das metabolische Syndrom auslöst. Die veränderte Darmphysiologie nach RYGB und SG wird zu identifizierbaren Veränderungen in spezifischen mikrobiellen Populationen und einer Zunahme der Diversität führen. Spezifische vorteilhafte mikrobielle Veränderungen führen anschließend zu Gewichtsverlust, reduzierter Entzündung und einem normalisierten Stoffwechselprofil.

METHODEN Studienpopulation: Die Patienten werden von der Edmonton Adult Specialty Bariatric Clinic im Royal Alexandra Hospital rekrutiert.

Stichprobengröße: Jede Kohorte von RYGB-, SG- und nicht-chirurgischen Ernährungskontrollen umfasst 30 Patienten (insgesamt n = 90). Frühere Studien umfassten 15 oder weniger Teilnehmer pro Arm.

Berechnung der Stichprobengröße: Die Berechnung der Stichprobengröße wurde entwickelt, um sicherzustellen, dass die Studie mikrobiologische Veränderungen, die durch eine Operation verursacht werden, angemessen erfasst. In der Literatur des Standes der Technik wird eine wichtige Bakterienart, die kurzkettige Fettsäuren produziert (F. prausnitzii) war die relative Häufigkeit in einer Post-RYGB-Gruppe niedriger als bei nicht-operativen Kontrollen (0,031 vs. 0,053 σ 0,024). Bei einem Alpha von 0,05 und einem Beta von 0,90 würde dies 26 Probanden pro Arm erfordern. Unter Berücksichtigung einer Dropout-Rate von 10 % erhöht sich dies auf 30 Probanden pro Arm.

Studiendesign: Für den Interventionsarm werden die Probanden zu dem Zeitpunkt aufgenommen, zu dem sie für die Operation geplant sind. Stuhl-, Urin- und Blutproben werden 2-6 Wochen vor der Operation in der Klinik gesammelt. In der postoperativen Phase findet die Fäkaliensammlung bei planmäßigen drei- und neunmonatigen Klinikbesuchen statt. Alle präoperativen Proben werden gesammelt, bevor die Probanden eine 2-4-wöchige präoperative Flüssigkeit einleiten, die darauf abzielt, die Hepatomegalie zu reduzieren und die technischen chirurgischen Aspekte des Verfahrens zu erleichtern.

Nicht-chirurgische Kontrollen sind Patienten, die mit Ernährungs- und Verhaltensinterventionen zur Gewichtsabnahme behandelt werden. Dies schließt Ernährungs- und Aktivitätsänderungen ein und schließt Mahlzeitenersatz oder pharmakologische Eingriffe aus. Für diese Kohorte werden den Probanden erste Proben (Kot, Urin, Blut) entnommen, bevor Interventionen zur Gewichtsabnahme eingeleitet werden. Weitere Probenahmen erfolgen dann drei Monate und neun Monate nach Beginn der Intervention.

Die Probenverarbeitung und Immunanalyse findet am Exzellenzzentrum für gastrointestinale Entzündungs- und Immunitätsforschung (CEGIIR) an der University of Alberta statt. Die Sequenzierung wird vom Applied Genomics Center innerhalb des CEGIIR durchgeführt, und die Metabolomik wird im Metabolomic Innovation Center der University of Alberta gegen eine Servicegebühr durchgeführt.

Fäkale mikrobielle Analyse: Die Entnahme von Fäkalproben wird durch ein zuvor entwickeltes Protokoll gesteuert, das von unserer Gruppe für Ernährungsstudien bei entzündlichen Darmerkrankungen verwendet wird. Den Patienten werden Entnahmebecher zur Verfügung gestellt, und sie werden angewiesen, am Abend vor oder am Morgen ihres Termins eine Probe zu entnehmen. Die Probanden werden angewiesen, die Probe in der Zwischenzeit im Kühlschrank aufzubewahren. Stuhlproben werden auf mikrobielle Zusammensetzung, Entzündungssignale und fäkales Calprotectin analysiert.

Die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft von Stuhlproben wird mithilfe von 16S-rRNA-Genanalysen bewertet. DNA wird aus den fäkalen Homogenaten extrahiert, wobei enzymatische und mechanische Zelllyse mit dem QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) kombiniert werden. Die Zusammensetzung der fäkalen Mikrobiota wird durch 16S-rRNA-Tag-Sequenzierung unter Verwendung der MiSeq Illumina-Technologie (Pair-End) charakterisiert, die auf die V3-V5-Regionen abzielt. Qualitätskontrollierte Lesevorgänge werden mit 1) taxonomischen Ansätzen wie Global Alignment for Sequence Taxonomy (GAST)15 und dem Ribosomal Database Project MultiClassifier-Tool und 2) nicht taxonomischen Clustering-Algorithmen zur Bestimmung der operationellen taxonomischen Einheit mit UPARSE analysiert Pipeline. Alpha-Diversitäts- (beobachtete Arten, Shannon, Simpson) und β-Diversitäts-Indizes (Bray-Curtis, binärer Jaccard) werden in QIIME und R (VEGAN-Paket) berechnet. Ordnungsdiagramme für β-Diversitätsmetriken werden durch nichtparametrische multidimensionale Skalierungsordnung in R generiert. Um die funktionelle Zusammensetzung des Mikrobioms zu bewerten, wird der Gengehalt der mikrobiellen Gemeinschaft unter Verwendung des PICRUSt-Algorithmus abgeleitet16. PICRUSt verwendet Informationen über den Gengehalt und die Kopienzahl des 16S-rRNA-Gens aus der IMG-Datenbank (integrierte mikrobielle Genome), um vorherzusagen, welche Gene in den Organismen der Versuchsproben vorhanden sind. Mit QIIME/UPPARSE generierte OTUs-Tabellen werden durch die 16S-rRNA-Genkopienzahl normalisiert, und solche normalisierten Werte werden mit der berechneten Häufigkeit von Genfamilien in jedem Taxon während des mit PICRUSt durchgeführten Geninhalts-Inferenzverfahrens multipliziert. Das Ergebnis ist eine Tabelle der Genfamilienzahlen, die mit denen vergleichbar ist, die von Metagenom-Annotationspipelines wie HUMAnN und MG-RAST generiert werden, und die in Stoffwechselwege organisiert werden kann. Schließlich wird der Beitrag jeder OTU zu einer gegebenen Genfunktion quantifiziert. Um mikrobielle Populationen und Stoffwechselwege mit unterschiedlicher Häufigkeit in den verschiedenen Gruppen zu identifizieren, wird der LDA (Linear Discriminant Analysis) Effect Size (LEfSe)-Algorithmus mit der Online-Schnittstelle Galaxy (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy /Wurzel).

Urin- und Serummetabolomik: Urin- und Blutproben werden während des Klinikbesuchs des Probanden gesammelt. Urinproben werden in einem Standard-Urinsammelgefäß entnommen, das Natriumazid enthält, um Bakterienwachstum zu verhindern, und nach der Entnahme eingefroren. Blutproben werden in heparinisierten Entnahmeröhrchen zum Zeitpunkt routinemäßiger, klinisch indizierter Blutuntersuchungen entnommen, insbesondere sechs Wochen vor der Operation und drei und neun Monate nach der Operation. Das Serum wird nach der Entnahme durch 10-minütige Zentrifugation bei 2 000 g isoliert und bei -80⁰C gelagert. Urin- und Serumproben werden zu jedem Zeitpunkt für die Metabolomik-Profilierung mittels NMR-Spektroskopie verwendet.

Metabolomische Profile werden mit NMR-Spektroskopie durch das Metabolomics Innovation Center an der University of Alberta erstellt. Die Proben werden auf einem Varian INOVA 600 MHz NMR-Spektrometer mit 4 Kanälen laufen gelassen. Standard-Chenomx-Erfassungs- und -Verarbeitungsparameter werden befolgt. Die 1 H-NMR-Analyse mit der Software Chenomx NMR Suite ermöglicht die gleichzeitige Identifizierung von bis zu 300 kleinen Molekülen. Die resultierenden NMR-Spektren werden einer Analyse unter Verwendung der Technik der gezielten Profilerstellung unterzogen, wobei die Spektren mit einer bekannten Referenzdatenbank verglichen werden, um Metaboliten zu identifizieren.

Entzündliche Zytokine und Chemokine: Das Serum wird zur Messung der Erythropoietin-Sedimentationsrate (ESR) und des C-reaktiven Proteins (CRP) als Maß der systemischen Entzündung und LPS als Maß der bakteriellen Translokation bewertet.

Sowohl Serum- als auch Gewebeproben werden auf entzündliche Zytokine und Chemokine analysiert. Zum Zeitpunkt der Operation werden Gewebeproben von einem Mitglied des Studienteams entnommen. Bei SG-Patienten wird eine Schleimhautprobe aus dem Magen und bei RYGB-Patienten sowohl aus dem Magen als auch aus dem Jejunum entnommen, im Operationssaal mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend bei -80 °C gelagert. Diese Proben werden als Standardteil der Verfahren entfernt. Sie werden auf entzündliche Zytokine analysiert. Die Ermittler haben in früheren Studien eine gute Arbeitsbeziehung mit OP-Personal und Chirurgen in unseren Städten aufgebaut, was diesen Prozess erleichtern wird.

Die Immunantwort des Wirts wird in Proben durch Proteinexpression von Zytokinen und Chemokinen unter Verwendung der Meso Scale Discovery-Plattform (MSD, Gaithersburg, Maryland, USA) bewertet. Die Verwendung dieser Multi-Array-Technologie wird uns einen dynamischen Bereich und die Empfindlichkeit bieten, eine große Anzahl von entzündlichen und homöostatischen Signalen gleichzeitig in einer einzigen Probe zu messen. Angesichts der offensichtlichen Beziehung zwischen Adipositaschirurgie, Gewichtsverlust und Gallensäuren werden sich die Forscher zunächst auf Zytokine konzentrieren, die an den Signalwegen des Farnesoid-X-Rezeptors beteiligt sind17. Zu diesen Zytokinen gehören insbesondere IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, TNFα und MCP-1.

Analyse: Ein systembiologischer Ansatz wird verwendet, um die Metagenomik, Metabolomik und Multiplex-Immunprofilerstellung zu kombinieren, um die kombinierten mikrobiellen, metabolischen und immunologischen Veränderungen zu definieren, die nach einer bariatrischen Operation auftreten. Unterschiede zwischen kontinuierlichen Variablen und dem Ergebnis werden durch den Wilcoxon-Rangsummentest bewertet. Unterschiede zwischen kategorialen erklärenden Variablen und dem Ergebnis werden mit dem Chi-Quadrat-Test oder dem exakten Fisher-Test bewertet, wenn die Zellengröße <5 ist. Variablen, die auf dem p < 0,10-Niveau durch Likelihood-Ratio-Tests aus der univariaten logistischen Regression signifikant sind, werden in die multivariable logistische Regression eingegeben. Es wird ein schrittweises Rückwärtsauswahlverfahren verwendet, und diejenigen Variablen mit einem Wahrscheinlichkeitsverhältnis p-Wert < 0,05 werden in dem multivariablen Modell beibehalten. QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology), MEGAN (MEtaGenome Analyzer) und Metastats werden unter Verwendung des am CEGIIR entwickelten Fachwissens und in Zusammenarbeit mit Dr. Gane Wong, einem Experten für Systembiologie, durchgeführt.

EINSCHRÄNKUNGEN

• Anwendbarkeit der Änderungen in der Adipositaschirurgie auf die Gewichtsabnahme im Allgemeinen
• Ursache und Wirkung von Veränderungen unterscheiden
• Bewertung der Auswirkungen von Ernährungsumstellungen nach und vor einer Operation