Microbiologia da Cirurgia Bariátrica

HIPÓTESE Os investigadores levantam a hipótese de que a disbiose microbiana intestinal e a diminuição da diversidade contribuem para o desenvolvimento e perpetuação da obesidade. O efeito da disbiose é multifatorial e inclui uma diminuição da função da barreira intestinal e consequente inflamação local e sistêmica que incita a síndrome metabólica. A fisiologia intestinal alterada após RYGB e SG levará a mudanças identificáveis ​​em populações microbianas específicas e um aumento na diversidade. Alterações microbianas benéficas específicas resultarão subsequentemente em perda de peso, redução da inflamação e um perfil metabólico normalizado.

MÉTODOS População do estudo: Os pacientes serão recrutados na Edmonton Adult Specialty Bariatric Clinic no hospital Royal Alexandra.

Tamanho da amostra: Cada coorte de RYGB, SG e controles dietéticos não cirúrgicos terá 30 pacientes (n total = 90). Estudos anteriores incluíram 15 ou menos participantes por braço.

Cálculo do tamanho da amostra: O cálculo do tamanho da amostra foi projetado para garantir que o estudo capturasse adequadamente as alterações microbianas induzidas pela cirurgia. Na literatura anterior, uma importante espécie bacteriana produtora de ácidos graxos de cadeia curta (F. prausnitzii) a abundância relativa foi menor em um grupo pós-RYGB em comparação com controles não cirúrgicos (0,031 v. 0,053 σ 0,024). Com um alfa de 0,05 e um beta de 0,90, isso exigiria 26 indivíduos por braço. Incluindo uma taxa de abandono de 10%, isso aumenta para 30 indivíduos por braço.

Desenho do estudo: Para o braço de intervenção, os indivíduos serão inscritos no momento em que forem agendados para a cirurgia. Amostras de fezes, urina e sangue serão coletadas na clínica 2 a 6 semanas antes da cirurgia. No período pós-operatório, a coleta de fezes ocorrerá em visitas clínicas agendadas de três e nove meses. Todas as amostras pré-operatórias serão coletadas antes de os indivíduos iniciarem um líquido pré-operatório de 2 a 4 semanas projetado para reduzir a hepatomegalia e facilitar os aspectos cirúrgicos técnicos do procedimento.

Os controles não cirúrgicos serão pacientes tratados com intervenções dietéticas e comportamentais para perda de peso. Isso inclui modificações dietéticas e de atividade e exclui substituição de refeições ou intervenções farmacológicas. Para esta coorte, os indivíduos terão uma amostra inicial (fecal, urina, sangue) coletada antes de iniciar as intervenções de perda de peso. Amostragem adicional ocorrerá em três meses e nove meses após o início da intervenção.

O processamento da amostra e a análise imunológica serão realizados no Centro de Excelência para Pesquisa de Imunidade e Inflamação Gastrointestinal (CEGIIR) da Universidade de Alberta. O sequenciamento será realizado pelo Centro de Genômica Aplicada do CEGIIR e a metabolômica será realizada no Centro de Inovação Metabolômica da Universidade de Alberta como uma taxa pelo serviço.

Análise microbiana fecal: A coleta de amostras fecais será conduzida por um protocolo desenvolvido anteriormente, usado por nosso grupo para estudos de dieta na doença inflamatória intestinal. Copos de coleta serão fornecidos aos pacientes e eles serão instruídos a coletar uma amostra na noite anterior ou na manhã de sua consulta. Os indivíduos serão instruídos a armazenar a amostra na geladeira nesse ínterim. Amostras fecais serão analisadas quanto à composição microbiana, sinais inflamatórios e calprotectina fecal.

A composição da comunidade microbiana das amostras fecais será avaliada por análises do gene 16S rRNA. O DNA será extraído dos homogenatos fecais combinando lise celular enzimática e mecânica com o QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, EUA). A composição da microbiota fecal será caracterizada por sequenciamento de tags 16S rRNA usando a tecnologia MiSeq Illumina (pair-end), visando as regiões V3-V5. As leituras controladas por qualidade serão analisadas usando 1) abordagens baseadas em taxonomia, como Global Alignment for Sequence Taxonomy (GAST)15 e a ferramenta Ribosomal Database Project MultiClassifier e 2) algoritmos de clustering não taxonômicos para determinação da Unidade Taxonômica Operacional com o UPARSE pipeline. Os índices alfa-diversidade (espécies observadas, Shannon, Simpson) e β-diversidade (Bray-Curtis, binário Jaccard) serão calculados em QIIME e R (pacote VEGAN). Gráficos de ordenação para métricas de diversidade β serão gerados por ordenação de escala multidimensional não paramétrica em R. Para avaliar a composição funcional do microbioma, o conteúdo gênico da comunidade microbiana será inferido usando o algoritmo PICRUSt16. O PICRUSt usa informações sobre o conteúdo do gene e o número de cópias do gene 16S rRNA do banco de dados IMG (genomas microbianos integrados) para prever quais genes estão presentes nos organismos das amostras experimentais. Tabelas de OTUs geradas com QIIME/UPARSE serão normalizadas pelo número de cópias do gene 16S rRNA e tais valores normalizados são multiplicados pela abundância calculada de famílias de genes em cada táxon durante o procedimento de inferência de conteúdo gênico realizado com PICRUSt. O resultado é uma tabela de contagens de famílias de genes comparáveis ​​àquelas geradas por pipelines de anotação de metagenoma, como HUMAnN e MG-RAST, e que podem ser organizadas em vias metabólicas. Por fim, será quantificada a contribuição de cada OTU para uma determinada função gênica. Para identificar populações microbianas e vias metabólicas com abundância diferenciadora nos diferentes grupos, será utilizado o algoritmo LDA (Linear Discriminant Analysis) Effect Size (LEfSe) com a interface online Galaxy (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy /raiz).

Metabolômica de urina e soro: Amostras de urina e sangue serão coletadas durante a visita clínica do sujeito. As amostras de urina serão obtidas em um frasco de coleta de urina padrão contendo azida sódica para prevenir o crescimento bacteriano e congeladas após a coleta. Amostras de sangue serão coletadas em tubos de coleta heparinizados no momento do exame de sangue de rotina clinicamente indicado, especificamente seis semanas antes da cirurgia e três e nove meses após a cirurgia. O soro será isolado por centrifugação a 2 000 g por 10 minutos após a coleta e armazenado a -80⁰C. Amostras de urina e soro serão usadas para perfis metabolômicos usando espectroscopia de RMN em cada ponto de tempo.

O perfil metabolômico será feito com espectroscopia de NMR através do Centro de Inovação Metabolômica da Universidade de Alberta. As amostras serão executadas em um espectrômetro Varian INOVA 600 MHz NMR de 4 canais. Os parâmetros padrão de aquisição e processamento do Chenomx serão seguidos. A análise de 1H-NMR usando o software Chenomx NMR Suite permitirá a identificação simultânea de até 300 moléculas pequenas. Os espectros de RMN resultantes serão submetidos a análise usando a técnica de perfis direcionados comparando espectros a um banco de dados de referência conhecido para identificar metabólitos.

Citocinas e quimiocinas inflamatórias: O soro será avaliado para medição da velocidade de sedimentação de eritropoetina (VHS) e proteína C-reativa (PCR) como medidas de inflamação sistêmica, e LPS, como medida de translocação bacteriana.

As amostras de soro e tecido serão analisadas para citocinas e quimiocinas inflamatórias. Amostras de tecido serão coletadas por um membro da equipe de estudo no momento da cirurgia. Uma amostra da mucosa do estômago será coletada para pacientes SG e do estômago e jejuno para pacientes RYGB, congelada rapidamente na sala de cirurgia usando nitrogênio líquido e posteriormente armazenada a -80⁰C. Essas amostras são removidas como parte padrão dos procedimentos. Eles serão analisados ​​para citocinas inflamatórias. Os investigadores estabeleceram uma boa relação de trabalho com a equipe de cirurgia e cirurgiões em nossas cidades em estudos anteriores, o que facilitará esse processo.

A resposta imune do hospedeiro será avaliada em amostras pela expressão proteica de citocinas e quimiocinas utilizando a plataforma Meso Scale Discovery (MSD, Gaithersburg, Maryland USA). O uso dessa tecnologia multiarray nos fornecerá uma faixa dinâmica e a sensibilidade para medir um grande número de sinais inflamatórios e homeostáticos simultaneamente em uma única amostra. Os investigadores irão focar inicialmente na citocina envolvida nas vias do receptor Farnesoid X, dada a aparente relação entre cirurgia bariátrica, perda de peso e ácidos biliares17. Especificamente, essas citocinas incluem IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, TNFα e MCP-1.

Análise: Uma abordagem de biologia de sistemas será usada para combinar metagenômica, metabolômica e perfis imunológicos multiplex para definir as alterações microbianas, metabólicas e imunológicas combinadas que ocorrem após a cirurgia bariátrica. As diferenças entre as variáveis ​​contínuas e o desfecho serão avaliadas pelo teste de soma de postos de Wilcoxon. As diferenças entre as variáveis ​​explicativas categóricas e o desfecho serão avaliadas pelo teste qui-quadrado ou teste exato de Fisher quando o tamanho da célula for <5. As variáveis ​​significativas no nível p < 0,10 pelo teste de razão de verossimilhança da regressão logística univariada serão inseridas na regressão logística multivariada. Será utilizado um procedimento de seleção reverse stepwise e as variáveis ​​com p-valor de razão de verossimilhança <0,05 serão mantidas no modelo multivariável. QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology), MEGAN (MEtaGenome Analyzer) e Metastats serão realizados usando a experiência desenvolvida no CEGIIR e em colaboração com o Dr. Gane Wong, um especialista em biologia de sistemas.

LIMITAÇÕES

• Aplicabilidade das modificações da cirurgia bariátrica ao emagrecimento em geral
• Diferenciando causa e efeito de mudanças
• Avaliação do efeito das mudanças na dieta após e antes da cirurgia