비만 수술의 미생물학

가설 연구자들은 장내 미생물 불균형과 다양성의 감소가 비만의 발달과 지속에 기여한다는 가설을 세웁니다. 세균불균형의 영향은 다인자적이며 장 장벽 기능의 감소와 대사 증후군을 유발하는 결과적인 국소 및 전신 염증을 포함합니다. RYGB 및 SG 이후 변경된 장 생리학은 특정 미생물 개체군의 식별 가능한 변화와 다양성의 증가로 이어질 것입니다. 특정 유익한 미생물 변화는 체중 감소, 염증 감소 및 정상화된 대사 프로파일을 초래할 것입니다.

방법 연구 모집단: Royal Alexandra 병원의 Edmonton Adult Specialty Bariatric Clinic에서 환자를 모집합니다.

샘플 크기: RYGB, SG 및 비외과적 식이 조절의 각 코호트에는 30명의 환자가 있습니다(총 n = 90). 이전 연구에는 팔당 15명 이하의 참가자가 포함되었습니다.

샘플 크기 계산: 샘플 크기 계산은 연구가 수술로 유도된 미생물 변화를 적절하게 포착하도록 설계되었습니다. 선행 문헌에서 중요한 단쇄 지방산 생산 박테리아 종'(F. prausnitzii) 비수술 대조군에 비해 RYGB 후 군에서 상대적 풍부도가 더 낮았다(0.031 v. 0.053 σ 0.024). 알파가 0.05이고 베타가 0.90이면 팔당 26명의 피험자가 필요합니다. 탈락률 10%를 포함하면 팔당 30명의 피험자로 증가합니다.

연구 설계: 개입 부문의 경우 피험자는 수술 예정 시간에 등록됩니다. 대변, 소변 및 혈액 샘플은 수술 2-6주 전에 클리닉에서 수집됩니다. 수술 후 기간에 배설물 수집은 예정된 3개월 및 9개월 클리닉 방문에서 이루어집니다. 모든 수술 전 샘플은 간비대를 줄이고 절차의 기술적 외과적 측면을 용이하게 하기 위해 고안된 2-4주 수술 전 액체를 피험자가 시작하기 전에 수집될 것입니다.

비수술 대조군은 체중 감량을 위해 식이요법 및 행동 중재로 치료를 받는 환자입니다. 여기에는 식이 및 활동 수정이 포함되며 식사 대체 또는 약리학적 개입은 제외됩니다. 이 코호트의 경우 대상자는 체중 감량 중재를 시작하기 전에 초기 샘플링(대변, 소변, 혈액)을 받게 됩니다. 추가 샘플링은 개입 시작 후 3개월 및 9개월 후에 발생합니다.

샘플 처리 및 면역 분석은 앨버타 대학의 위장 염증 및 면역 연구 우수 센터(CEGIIR)에서 수행됩니다. 시퀀싱은 CEGIIR 내의 Applied Genomics Center에서 수행하고 Metabolomics는 University of Alberta의 Metabolomic Innovation Center에서 서비스 요금으로 수행합니다.

배설물 미생물 분석: 배설물 샘플 수집은 염증성 장 질환의 식이 연구를 위해 우리 그룹에서 사용하는 이전에 개발된 프로토콜에 의해 구동됩니다. 수집 컵은 환자에게 제공되며 약속 전날 밤이나 아침에 검체를 수집하도록 지시받을 것입니다. 피험자는 중간에 표본을 냉장고에 보관하도록 지시를 받습니다. 대변 ​​샘플은 미생물 조성, 염증 신호 및 대변 칼프로텍틴에 대해 분석됩니다.

대변 ​​샘플의 미생물 군집 구성은 16S rRNA 유전자 분석을 사용하여 평가됩니다. QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 효소 및 기계적 세포 용해를 결합한 대변 균질액에서 DNA를 추출합니다. 분변 미생물 구성은 V3-V5 영역을 대상으로 하는 MiSeq Illumina 기술(페어 엔드)을 사용하는 16S rRNA 태그 시퀀싱으로 특성화됩니다. 품질 제어 읽기는 1) GAST(Global Alignment for Sequence Taxonomy)15 및 Ribosomal Database Project MultiClassifier 도구와 같은 분류학 기반 접근 방식과 2) UPARSE를 사용한 운영 분류학 단위 결정을 위한 비분류학 기반 클러스터링 알고리즘을 사용하여 분석됩니다. 관로. 알파-다양성(관측된 종, Shannon, Simpson) 및 β-다양성 지수(Bray-Curtis, binary Jaccard)는 QIIME 및 R(VEGAN 패키지)에서 계산됩니다. β-다양성 메트릭에 대한 좌표 플롯은 R의 비모수적 다차원 스케일링 좌표에 의해 생성됩니다. 마이크로바이옴의 기능적 구성을 평가하기 위해 미생물 군집의 유전자 함량은 PICRUSt 알고리즘을 사용하여 추론됩니다16. PICRUSt는 IMG(통합 미생물 게놈) 데이터베이스의 유전자 함량 및 16S rRNA 유전자 사본 수에 대한 정보를 사용하여 실험 샘플의 유기체에 어떤 유전자가 존재하는지 예측합니다. QIIME/UPARSE로 생성된 OTUs 테이블은 16S rRNA 유전자 카피 수로 정규화되며 이러한 정규화된 값은 PICRUST로 수행된 유전자 함량 추론 절차 동안 각 분류군에서 계산된 유전자 패밀리의 풍부도로 곱해집니다. 결과는 HUMAnN 및 MG-RAST와 같은 메타게놈 주석 파이프라인에 의해 생성된 것과 유사하고 대사 경로로 구성될 수 있는 유전자 패밀리 수의 표입니다. 마지막으로 주어진 유전자 기능에 대한 각 OTU의 기여도를 정량화합니다. 서로 다른 그룹에서 풍부함을 차별화하는 미생물 개체군과 대사 경로를 식별하기 위해 LDA(선형 판별 분석) 효과 크기(LEfSe) 알고리즘을 온라인 인터페이스 Galaxy(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy)와 함께 사용합니다. /뿌리).

소변 및 혈청 대사체학: 소변 및 혈액 샘플은 피험자의 클리닉 방문 중에 수집됩니다. 소변 샘플은 박테리아 성장을 방지하기 위해 아지드화나트륨이 들어 있는 표준 소변 수집 용기에서 채취하고 수집 후 냉동합니다. 혈액 샘플은 일상적인 임상적으로 지시된 혈액 검사 시, 특히 수술 전 6주 및 수술 후 3개월 및 9개월 동안 헤파린 처리된 수집 튜브에서 수집됩니다. 혈청은 수집 후 10분 동안 2,000g에서 원심분리하여 분리하고 -80⁰C에서 보관합니다. 소변 및 혈청 샘플은 각 시점에서 NMR 분광법을 사용하여 대사체학 프로파일링에 사용됩니다.

대사체 프로파일링은 앨버타 대학의 대사체학 혁신 센터를 통해 NMR 분광법으로 수행됩니다. 샘플은 4채널 Varian INOVA 600MHz NMR 분광계에서 실행됩니다. 표준 Chenomx 획득 및 처리 매개변수를 따릅니다. 1 Chenomx NMR Suite 소프트웨어를 사용한 H-NMR 분석은 최대 300개의 작은 분자를 동시에 식별할 수 있습니다. 생성된 NMR 스펙트럼은 스펙트럼을 알려진 참조 데이터베이스와 비교하는 표적 프로파일링 기술을 사용하여 분석되어 대사산물을 식별합니다.

염증성 사이토카인 및 케모카인: 혈청은 전신 염증의 측정으로서 에리스로포이에틴 침강 속도(ESR) 및 C-반응성 단백질(CRP)의 측정을 위해, 그리고 박테리아 전좌의 측정으로서 LPS를 평가할 것입니다.

혈청 및 조직 샘플 모두 염증성 사이토카인 및 케모카인에 대해 분석될 것입니다. 수술 시 연구 팀원이 조직 샘플을 수집합니다. SG 환자의 경우 위 점막 표본을, RYGB 환자의 경우 위와 공장 모두에서 점막 표본을 채취하여 액체 질소를 사용하여 수술실에서 급속 냉동한 후 -80⁰C에 보관합니다. 이 표본은 절차의 표준 부분으로 제거됩니다. 그들은 염증성 사이토카인에 대해 분석될 것입니다. 조사관은 이 과정을 용이하게 할 이전 연구에서 우리 도시 주변의 수술실 직원 및 외과 의사와 좋은 업무 관계를 수립했습니다.

숙주 면역 반응은 Meso Scale Discovery 플랫폼(MSD, Gaithersburg, Maryland USA)을 사용하여 사이토카인 및 케모카인의 단백질 발현에 의해 샘플에서 평가될 것입니다. 이 다중 배열 기술을 사용하면 단일 샘플에서 많은 염증 및 항상성 신호를 동시에 측정할 수 있는 동적 범위와 감도를 제공할 것입니다. 연구자들은 처음에는 비만 수술, 체중 감소 및 담즙산 사이의 명백한 관계를 고려할 때 Farnesoid X 수용체 경로에 관련된 사이토카인에 초점을 맞출 것입니다17. 구체적으로, 이들 사이토카인은 IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, TNFα 및 MCP-1을 포함한다.

분석: 비만 수술 후 발생하는 결합된 미생물, 대사 및 면역학적 변화를 정의하기 위해 metagenomics, metabolomics 및 다중 면역 프로파일링을 결합하기 위해 시스템 생물학 접근법이 사용될 것입니다. 연속 변수와 결과 간의 차이는 Wilcoxon 순위 합계 테스트로 평가됩니다. 범주형 설명 변수와 결과 간의 차이는 세포 크기가 <5일 때 카이제곱 테스트 또는 Fisher의 정확 테스트로 평가됩니다. 단변량 로지스틱 회귀에서 우도 비율 테스트에 의해 p < 0.10 수준에서 유의한 변수는 다변수 로지스틱 회귀에 입력됩니다. 역방향 단계적 선택 절차가 활용되고 우도 비율 p-값이 0.05 미만인 변수는 다변수 모델에서 유지됩니다. QIIME(Quantitative Insights Into Microbial Ecology), MEGAN(MEtaGenome Analyzer) 및 Metastats는 CEGIIR에서 개발한 전문 기술을 사용하고 시스템 생물학 전문가인 Gane Wong 박사와 협력하여 수행됩니다.

제한 사항

• 일반적인 체중 감량에 대한 비만 수술의 변화 적용 가능성
• 변화의 원인과 결과 구별
• 수술 후 및 수술 전 식이 변화의 효과 평가