Mikrobiologia chirurgii bariatrycznej

HIPOTEZA Badacze stawiają hipotezę, że dysbioza drobnoustrojów jelitowych i spadek różnorodności przyczynia się do rozwoju i utrwalania się otyłości. Efekt dysbiozy jest wieloczynnikowy i obejmuje zmniejszenie funkcji bariery jelitowej i wynikający z tego miejscowy i ogólnoustrojowy stan zapalny, który wywołuje zespół metaboliczny. Zmieniona fizjologia jelit po RYGB i SG doprowadzi do możliwych do zidentyfikowania zmian w określonych populacjach drobnoustrojów i wzrostu różnorodności. Konkretne korzystne zmiany mikrobiologiczne spowodują następnie utratę wagi, zmniejszenie stanu zapalnego i normalizację profilu metabolicznego.

METODY Badana populacja: Pacjenci będą rekrutowani ze specjalistycznej kliniki bariatrycznej dla dorosłych w Edmonton w szpitalu Royal Alexandra.

Wielkość próby: Każda kohorta kontrolna RYGB, SG i niechirurgicznej diety będzie liczyć 30 pacjentów (łącznie n = 90). Poprzednie badania obejmowały 15 lub mniej uczestników na ramię.

Obliczenie wielkości próbki: Obliczenie wielkości próby zostało zaprojektowane w celu zapewnienia, że ​​badanie odpowiednio uchwyci zmiany drobnoustrojów wywołane zabiegiem chirurgicznym. We wcześniejszej literaturze ważny gatunek bakterii wytwarzający krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (F. prausnitzii) względna obfitość była niższa w grupie po RYGB w porównaniu z kontrolami nieoperacyjnymi (0,031 v. 0,053 σ 0,024). Przy alfa 0,05 i beta 0,90 wymagałoby to 26 pacjentów na ramię. Uwzględniając wskaźnik rezygnacji wynoszący 10%, liczba ta wzrasta do 30 pacjentów na ramię.

Projekt badania: Do grupy interwencyjnej uczestnicy zostaną włączeni w czasie zaplanowanej operacji. Próbki kału, moczu i krwi zostaną pobrane w klinice 2-6 tygodni przed operacją. W okresie pooperacyjnym pobieranie kału odbywać się będzie podczas planowych wizyt w poradni trzy- i dziewięciomiesięcznej. Wszystkie próbki przedoperacyjne zostaną pobrane przed rozpoczęciem przez pacjentów 2-4-tygodniowego podawania płynów przedoperacyjnych, zaprojektowanych w celu zmniejszenia hepatomegalii i ułatwienia technicznych aspektów chirurgicznych procedury.

Nieoperacyjnymi kontrolami będą pacjenci, którzy są leczeni interwencjami dietetycznymi i behawioralnymi w celu utraty wagi. Obejmuje to modyfikacje diety i aktywności oraz wyklucza zastępowanie posiłków lub interwencje farmakologiczne. W przypadku tej kohorty od pacjentów pobiera się wstępne próbki (kału, moczu, krwi) przed rozpoczęciem interwencji odchudzających. Dalsze pobieranie próbek nastąpi po trzech i dziewięciu miesiącach od rozpoczęcia interwencji.

Przetwarzanie próbek i analiza immunologiczna będą miały miejsce w Centrum Doskonałości Badań nad Zapaleniem Żołądkowo-Jelitowym i Odpornością (CEGIIR) na Uniwersytecie Alberty. Sekwencjonowanie zostanie przeprowadzone przez Centrum Genomiki Stosowanej w ramach CEGIIR, a metabolomika w Centrum Innowacji Metabolomicznych na Uniwersytecie Alberty w ramach opłaty za usługę.

Analiza mikrobiologiczna kału: Pobieranie próbek kału będzie oparte na wcześniej opracowanym protokole stosowanym przez naszą grupę do badań diety w nieswoistym zapaleniu jelit. Pojemniki do pobierania zostaną dostarczone pacjentom i zostaną oni poinstruowani, aby pobrać próbkę w nocy poprzedzającej lub rano w dniu wizyty. Badani zostaną poinstruowani, aby w międzyczasie przechowywać próbkę w lodówce. Próbki kału zostaną przeanalizowane pod kątem składu mikrobiologicznego, sygnałów zapalnych i kalprotektyny w kale.

Skład społeczności mikrobiologicznej próbek kału zostanie oceniony przy użyciu analiz genu 16S rRNA. DNA zostanie wyekstrahowane z homogenatów kału przy użyciu enzymatycznej i mechanicznej lizy komórek za pomocą zestawu QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Skład mikroflory kałowej zostanie scharakteryzowany poprzez sekwencjonowanie znacznika 16S rRNA przy użyciu technologii MiSeq Illumina (koniec pary), ukierunkowanej na regiony V3-V5. Odczyty kontrolowane pod względem jakości będą analizowane przy użyciu 1) podejść opartych na taksonomii, takich jak Global Alignment for Sequence Taxonomy (GAST)15 i narzędzie Ribosomal Database Project MultiClassifier oraz 2) nieoparte na taksonomii algorytmy grupowania do określania jednostek taksonomicznych operacyjnych za pomocą UPARSE rurociąg. Wskaźniki różnorodności alfa (obserwowane gatunki, Shannon, Simpson) i różnorodności β (Bray-Curtis, binarny Jaccard) zostaną obliczone w QIIME i R (pakiet VEGAN). Wykresy porządkowe dla metryk różnorodności β zostaną wygenerowane przez nieparametryczne wielowymiarowe skalowanie ordynacji w R. W celu oceny składu funkcjonalnego mikrobiomu zawartość genów społeczności drobnoustrojów zostanie wywnioskowana za pomocą algorytmu PICRUSt16. PICRUST wykorzystuje informacje o zawartości genów i liczbie kopii genu 16S rRNA z bazy danych IMG (zintegrowane genomy drobnoustrojów) do przewidywania, które geny są obecne w organizmach z próbek eksperymentalnych. Tabele OTU wygenerowane za pomocą QIIME / UPARSE zostaną znormalizowane przez liczbę kopii genu 16S rRNA, a takie znormalizowane wartości są mnożone przez obliczoną obfitość rodzin genów w każdym taksonie podczas procedury wnioskowania o zawartości genów przeprowadzanej za pomocą PICRUST. Rezultatem jest tabela zliczeń rodzin genów, która jest porównywalna z tymi generowanymi przez potoki adnotacji metagenomu, takie jak HUMAnN i MG-RAST, i które można uporządkować w szlaki metaboliczne. Na koniec zostanie określony ilościowo udział każdego OTU w danej funkcji genu. Aby zidentyfikować populacje drobnoustrojów i szlaki metaboliczne ze zróżnicowaną obfitością w różnych grupach, algorytm LDA (Linear Discriminant Analysis) Effect Size (LEfSe) zostanie wykorzystany z interfejsem online Galaxy (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy /źródło).

Metabolomika moczu i surowicy: Próbki moczu i krwi zostaną pobrane podczas wizyty pacjenta w klinice. Próbki moczu zostaną pobrane w standardowym słoiku do zbiórki moczu zawierającym azydek sodu, aby zapobiec rozwojowi bakterii i zamrożone po pobraniu. Próbki krwi będą pobierane do heparynizowanych probówek w czasie rutynowych, klinicznie wskazanych badań krwi, w szczególności sześć tygodni przed operacją oraz trzy i dziewięć miesięcy po operacji. Surowica zostanie wyizolowana przez wirowanie przy 2 000 g przez 10 minut po pobraniu i będzie przechowywana w temperaturze -80⁰C. Próbki moczu i surowicy zostaną użyte do profilowania metabolomicznego przy użyciu spektroskopii NMR w każdym punkcie czasowym.

Profilowanie metabolomiczne zostanie wykonane za pomocą spektroskopii NMR przez Centrum Innowacji Metabolomiki na Uniwersytecie Alberty. Próbki będą analizowane na 4-kanałowym spektrometrze NMR Varian INOVA 600 MHz. Przestrzegane będą standardowe parametry akwizycji i przetwarzania Chenomx. 1 Analiza H-NMR przy użyciu oprogramowania Chenomx NMR Suite pozwoli na jednoczesną identyfikację do 300 małych cząsteczek. Uzyskane widma NMR zostaną poddane analizie z wykorzystaniem techniki ukierunkowanego profilowania porównującego widma ze znaną referencyjną bazą danych w celu identyfikacji metabolitów.

Cytokiny i chemokiny zapalne: Surowica zostanie oceniona pod kątem pomiaru szybkości sedymentacji erytropoetyny (ESR) i białka C-reaktywnego (CRP) jako pomiaru ogólnoustrojowego stanu zapalnego oraz LPS jako pomiaru translokacji bakteryjnej.

Zarówno próbki surowicy, jak i tkanki zostaną przeanalizowane pod kątem cytokin zapalnych i chemokin. Próbki tkanek zostaną pobrane przez członka zespołu badawczego w czasie operacji. Próbka błony śluzowej żołądka zostanie pobrana w przypadku pacjentów z SG oraz z żołądka i jelita czczego w przypadku pacjentów z RYGB, szybko zamrożona na sali operacyjnej przy użyciu ciekłego azotu, a następnie przechowywana w temperaturze -80⁰C. Próbki te są usuwane jako standardowa część procedur. Zostaną one przeanalizowane pod kątem cytokin zapalnych. Badacze nawiązali dobre stosunki robocze z personelem sali operacyjnej i chirurgami w naszych miastach w poprzednich badaniach, co ułatwi ten proces.

Odpowiedź immunologiczna gospodarza zostanie oceniona w próbkach przez ekspresję białka cytokin i chemokin przy użyciu platformy Meso Scale Discovery (MSD, Gaithersburg, Maryland USA). Wykorzystanie tej wielomacierzowej technologii zapewni nam zakres dynamiki i czułość do pomiaru dużej liczby sygnałów zapalnych i homeostatycznych jednocześnie w jednej próbce. Badacze początkowo skupią się na cytokinach zaangażowanych w szlaki receptora Farnezoidu X, biorąc pod uwagę widoczny związek między chirurgią bariatryczną, utratą masy ciała i kwasami żółciowymi17. Konkretnie, te cytokiny obejmują IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, TNFα i MCP-1.

Analiza: Podejście biologii systemowej zostanie zastosowane do połączenia metagenomiki, metabolomiki i multipleksowego profilowania immunologicznego w celu zdefiniowania połączonych zmian mikrobiologicznych, metabolicznych i immunologicznych, które występują po operacji bariatrycznej. Różnice między zmiennymi ciągłymi a wynikiem zostaną ocenione za pomocą testu sumy rang Wilcoxona. Różnice między kategorialnymi zmiennymi objaśniającymi a wynikiem zostaną ocenione za pomocą testu chi-kwadrat lub dokładnego testu Fishera, gdy rozmiar komórki wynosi <5. Zmienne istotne na poziomie p < 0,10 w teście ilorazu wiarygodności z jednowymiarowej regresji logistycznej zostaną wprowadzone do wielowymiarowej regresji logistycznej. Zastosowana zostanie procedura wstecznej selekcji krokowej, a te zmienne, których iloraz wiarygodności p-wartość <0,05 zostaną utrzymane w modelu wielu zmiennych. QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology), MEGAN (MEtaGenome Analyzer) i Metastats zostaną przeprowadzone z wykorzystaniem wiedzy opracowanej w CEGIIR i we współpracy z dr Gane Wong, ekspertem w dziedzinie biologii systemowej.

OGRANICZENIA

• Zastosowanie zmian w chirurgii bariatrycznej do ogólnej utraty wagi
• Rozróżnianie przyczyny i skutku zmian
• Ocena wpływu zmian w diecie po i przed operacją