A bariatric sebészet mikrobiológiája

HIPOTÉZIS A kutatók azt feltételezik, hogy a bélmikrobiális dysbiosis és a diverzitás csökkenése hozzájárul az elhízás kialakulásához és fennmaradásához. A dysbiosis hatása többtényezős, és magában foglalja az intestinalis barrier funkció csökkenését, valamint az ebből eredő lokális és szisztémás gyulladást, amely metabolikus szindrómát vált ki. Az RYGB-t és az SG-t követő megváltozott bélfiziológia azonosítható változásokhoz vezet a specifikus mikrobapopulációkban és a diverzitás növekedéséhez. A specifikus előnyös mikrobiális változások ezt követően súlycsökkenést, csökkent gyulladást és normalizált anyagcsereprofilt eredményeznek.

MÓDSZEREK Vizsgálati populáció: A betegeket a Royal Alexandra Kórház Edmonton Specialty Bariatric Klinikájáról veszik fel.

Mintanagyság: Minden RYGB, SG és nem műtéti diétás kontrollcsoportban 30 beteg lesz (összesen n = 90). A korábbi tanulmányok karonként 15 vagy kevesebb résztvevőt vontak be.

Mintaméret-számítás: A mintaméret-számítást úgy tervezték, hogy a vizsgálat megfelelően rögzítse a műtét által kiváltott mikrobiális változásokat. A korábbi irodalomban egy fontos rövid szénláncú zsírsavtermelő baktériumfaj” (F. prausnitzii) relatív bősége alacsonyabb volt egy poszt-RYGB csoportban a nem operatív kontrollokhoz képest (0,031 v. 0,053 σ 0,024). 0,05 alfa és 0,90 béta esetén ehhez 26 alanyra lenne szükség karonként. A 10%-os lemorzsolódást is beleértve, ez karonként 30 alanyra nő.

A vizsgálat felépítése: A beavatkozási ágban az alanyok a műtétre tervezett időpontban kerülnek felvételre. A műtét előtt 2-6 héttel széklet-, vizelet- és vérmintát vesznek a klinikán. A posztoperatív időszakban a székletgyűjtés a tervezett három és kilenc hónapos klinikai látogatások alkalmával történik. Minden műtét előtti mintát gyűjtenek, mielőtt az alanyok 2-4 hetes műtét előtti folyadékot kezdenének a hepatomegalia csökkentésére és az eljárás technikai sebészeti vonatkozásainak megkönnyítésére.

A nem műtéti kontrollok azok a betegek, akiket étrendi és viselkedési beavatkozásokkal kezelnek a fogyás érdekében. Ez magában foglalja az étrend- és tevékenységmódosításokat, és kizárja az étkezés helyettesítését vagy a farmakológiai beavatkozásokat. Ebben a kohorszban az alanyoktól kezdeti mintát (széklet, vizelet, vér) vesznek a súlycsökkentő beavatkozások megkezdése előtt. A további mintavétel a beavatkozás megkezdését követő három és kilenc hónap elteltével történik.

A mintafeldolgozás és az immunelemzés az Albertai Egyetem Gastrointestinalis Inflammation and Immunity Research Kiválósági Központjában (CEGIIR) zajlik majd. A szekvenálást a CEGIIR-en belüli Alkalmazott Genomikai Központ végzi, a metabolomikát pedig az Albertai Egyetem Metabolomikus Innovációs Központjában végzik majd a szolgáltatás díjaként.

Széklet mikrobiológiai analízis: A székletminta gyűjtését egy korábban kifejlesztett protokoll vezérli, amelyet csoportunk a gyulladásos bélbetegség diétás vizsgálataihoz használt. Gyűjtőpoharakat kapnak a betegek, és utasítják őket, hogy a rendelést megelőző este vagy reggel vegyenek mintát. Az alanyokat arra utasítják, hogy közben a mintát a hűtőszekrényben tárolják. A székletmintákat elemzik a mikrobiális összetétel, a gyulladásos jelek és a széklet kalprotektin szempontjából.

A székletminták mikrobiális közösségének összetételét 16S rRNS génanalízissel értékeljük. A DNS-t a széklethomogenizátumokból vonják ki, az enzimatikus és mechanikus sejtlízist kombinálva a QIAamp DNA Stool Mini Kit-tel (Qiagen, Valencia, CA, USA). A széklet mikrobiota összetételét a 16S rRNS tag szekvenálásával jellemezzük a MiSeq Illumina technológiával (pár-end), amely a V3-V5 régiókat célozza meg. A minőség-ellenőrzött leolvasások elemzése 1) taxonómiai alapú megközelítésekkel, például Global Alignment for Sequence Taxonomy (GAST)15 és a Ribosomal Database Project MultiClassifier eszközzel, valamint 2) nem taxonómiai alapú klaszterező algoritmusokkal történik az operatív taxonómiai egységek meghatározásához az UPARSE segítségével. csővezeték. Az alfa-diverzitás (megfigyelt fajok, Shannon, Simpson) és a β-diverzitási indexek (Bray-Curtis, bináris Jaccard) QIIME-ben és R-ben (VEGAN csomag) kerülnek kiszámításra. A β-diverzitási metrikák ordinációs diagramjait nem paraméteres, többdimenziós skálázó ordinációval állítjuk elő R-ben. A mikrobióm funkcionális összetételének felmérése érdekében a mikrobiális közösség géntartalmára a PICRUSt algoritmus segítségével kell következtetni16. A PICRUSt az IMG (integrált mikrobiális genomok) adatbázisból származó géntartalomra vonatkozó információkat és a 16S rRNS génmásolat számát használja annak előrejelzésére, hogy mely gének vannak jelen a kísérleti minták szervezeteiben. A QIIME/UPARSE segítségével generált OTU-táblázatokat a 16S rRNS gén kópiaszámával normalizáljuk, és az ilyen normalizált értékeket megszorozzuk az egyes taxonok géncsaládjainak számított abundanciájával a PICRUSt-tal végzett géntartalom-következtetési eljárás során. Az eredmény egy táblázat a géncsaládok számáról, amely összehasonlítható a metagenom annotációs csővezetékek, például a HUMANN és ​​az MG-RAST által generált géncsaládok számával, és amely metabolikus útvonalakba szervezhető. Végül számszerűsítjük az egyes OTU-k hozzájárulását egy adott génfunkcióhoz. A különböző csoportokban eltérő bőséges mikrobiális populációk és metabolikus útvonalak azonosítására az LDA (Linear Discriminant Analysis) Effect Size (LEfSe) algoritmust használjuk a Galaxy online felülettel (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy). /gyökér).

Vizelet és szérum metabolomika: Vizelet- és vérmintákat gyűjtenek az alany klinikai látogatása során. A vizeletmintákat egy standard vizeletgyűjtő edényben veszik, amely nátrium-azidot tartalmaz a baktériumok növekedésének megakadályozása érdekében, és a gyűjtés után lefagyasztják. A vérmintákat heparinizált gyűjtőcsövekbe veszik a rutin klinikailag indokolt vérvételkor, különösen hat héttel a műtét előtt, valamint három és kilenc hónappal a műtét után. A szérumot 2000 g-vel 10 percig végzett centrifugálással izoláljuk az összegyűjtést követően, és -80 °C-on tároljuk. Minden időpontban vizelet- és szérummintákat használnak a metabolomikai profilok meghatározásához NMR-spektroszkópiával.

A metabolikus profilalkotást NMR spektroszkópiával végzik az Albertai Egyetem Metabolomikai Innovációs Központján keresztül. A mintákat 4 csatornás Varian INOVA 600 MHz NMR spektrométeren futtatjuk. A szabványos Chenomx beszerzési és feldolgozási paramétereket követik. A Chenomx NMR Suite szoftverrel végzett 1H-NMR elemzés akár 300 kis molekula egyidejű azonosítását teszi lehetővé. Az eredményül kapott NMR-spektrumokat a célzott profilalkotás technikájával elemzik, a spektrumokat egy ismert referencia adatbázissal összehasonlítva a metabolitok azonosítása céljából.

Gyulladásos citokinek és kemokinek: A szérumot az eritropoetin ülepedési sebességének (ESR) és a C-reaktív proteinnek (CRP) a szisztémás gyulladás mérésére, az LPS-t pedig a bakteriális transzlokáció mérésére értékelik.

A szérum- és szövetmintákat egyaránt elemzik a gyulladásos citokinek és kemokinek szempontjából. A szövetmintákat a vizsgálati csoport egyik tagja veszi a műtét idején. Nyálkahártya-mintát vesznek a gyomorból SG-s betegeknél, és mind a gyomorból, mind a jejunumból RYGB-betegeknél, a műtőben folyékony nitrogénnel gyorsfagyasztják, majd -80°C-on tárolják. Ezeket a mintákat az eljárások szokásos részeként eltávolítják. A gyulladásos citokineket elemezni fogják. A kutatók a korábbi tanulmányok során jó munkakapcsolatot alakítottak ki városaink műtői személyzetével és sebészeivel, ami elősegíti ezt a folyamatot.

A gazdaszervezet immunválaszát a mintákban citokinek és kemokinek fehérjeexpressziójával értékelik a Meso Scale Discovery platform (MSD, Gaithersburg, Maryland, USA) segítségével. Ennek a multi-array technológiának a használata dinamikus tartományt és érzékenységet biztosít számunkra, hogy nagyszámú gyulladásos és homeosztatikus jelet mérjünk egyidejűleg egyetlen mintában. A kutatók kezdetben a Farnesoid X receptor útvonalakban részt vevő citokinekre összpontosítanak, tekintettel a bariátriai műtét, a fogyás és az epesavak közötti nyilvánvaló kapcsolatra17. Közelebbről, ezek a citokinek közé tartozik az IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, TNFa és MCP-1.

Elemzés: Rendszerbiológiai megközelítést alkalmazunk a metagenomika, metabolomika és multiplex immunprofilok kombinálására, hogy meghatározzuk a bariátriai műtétek után fellépő kombinált mikrobiális, metabolikus és immunológiai változásokat. A folytonos változók és az eredmény közötti különbségeket Wilcoxon rangösszeg teszttel értékeljük. A kategorikus magyarázó változók és az eredmény közötti különbségeket a khi-négyzet teszttel vagy Fisher-féle egzakt teszttel értékelik, amikor a sejtméret <5. Az egyváltozós logisztikus regresszióból származó valószínűségi hányados vizsgálattal p < 0,10 szinten szignifikáns változók többváltozós logisztikus regresszióba kerülnek. Visszafelé lépésenkénti kiválasztási eljárást alkalmazunk, és azokat a változókat, amelyek valószínűségi aránya p-érték <0,05, megtartjuk a többváltozós modellben. A QIIME-t (Quantitative Insights Into Microbial Ecology), a MEGAN-t (MEtaGenome Analyzer) és a Metastats-t a CEGIIR-ben kifejlesztett szakértelem felhasználásával és Dr. Gane Wong rendszerbiológiai szakértővel együttműködve hajtják végre.

KORLÁTOZÁSOK

• A bariátriai sebészet változásainak alkalmazhatósága a fogyásra általában
• A változások okának és következményeinek megkülönböztetése
• A műtétet követő és azt megelőző étrendi változtatások hatásának felmérése