盐敏感性和免疫细胞激活

如前所述，研究人员将对 20 名患者采用 Weinberger 方案。 他们将建议参与者在方案开始之前保持他们通常的饮食和盐摄入量，并为他们提供一个容器和适当的说明，以便他们在入院前一天收集 24 小时尿液样本。 两周后入院，以消除药物的作用，并在晚上入院，让患者在开始治疗前在医院休息一夜。 在这两周内，未经治疗的血压将由患者在家中或临时定期就诊进行监测，以确保其不超过 180/110 mmHg，在这种情况下，出于安全考虑，该方案将被终止。 入院时，将测量基线尿液的体积，并将等分试样送到实验室或冷冻在 -800C 下用于研究分析。 在入院后的早上（早上 6 点），将设置动态血压监测仪（SpaceLabs 90207 或 90210）以在整个研究期间连续记录血压（从早上 6 点到晚上 10 点每 15 分钟一次，从晚上 10 点到晚上 30 分钟一次）早上 6 点），将记录穿着长袍的患者的体重（与未来几天相同的比例），将获取血液样本用于下述研究的分析物（基线测试），并且将进行新的 24 小时收集早上8点开始装盐。 盐负荷将通过结合高盐饮食（等热量，160 mEq Na 和 70 mEq K）（患者将完全食用）和输注 2L 生理盐水（300 mEq Na+）来实现。 患者可以自由饮水，但他们的食物将仅限于协议提供的食物。 他们将在晚上 10 点睡觉。 第二天早上（早上 6 点）将再次获取体重和血液样本，并在早上 8 点有意排尿的情况下完成 24 小时收集。 这些实验室数据将反映盐负荷的影响。 早上 8 点，受试者将被耗盐。 这是通过给予含有 10 mEq Na 和 70 mEq K 的等热量饮食并持续无限量饮水来实现的。 在上午 8 点、中午 12 点和下午 4 点，受试者将口服 40 毫克呋塞米。 额外的 12 小时尿液收集将从上午 8 点开始，并在晚上 8 点以故意排空结束（反映呋塞米尿钠排泄的时期）。 新的 12 小时收集将从晚上 8 点开始，第二天早上 8 点（反映盐耗尽期）以故意排尿结束。 第二天早上（早上 6 点）将进行最后一次体重记录和抽取血样，到早上 8 点将完成盐消耗期间的 12 小时尿液收集。 将为患者提供常规医院饮食中的早餐，如果盐消耗干预产生头晕或记录的体位性失调，则可以补充咸味食物或液体。 一旦患者稳定并表现出对直立姿势的耐受性，他/她将出院回家，并指导他恢复抗高血压药物治疗，除非存在直立性停滞需要修改方案，这将由研究的医师成员建议团队。

实验室血液测量：每日 3 组血液样本中进行的测试将包括； VUMC 中心实验室的 CBC 和常规化学（包括血清肌酐、Na+ 和 K+）；放射免疫测定血浆肾素活性；放射免疫测定血浆醛固酮；通过液相色谱/串联质谱分析 VUMC 类花生酸核心的血浆二十碳三烯酸 (EET) 和 20-羟基二十碳四烯酸 (20-HETE)。

尿液分析：将对 4 份尿液样本（24 小时基线、24 小时盐负荷、12 小时速尿钠尿和 12 小时盐消耗）进行的测试将包括； VUMC 中心实验室的 Na+、K+ 和肌酐浓度；通过液相色谱/串联质谱法分析 VUMC 类花生酸核心的尿二十碳三烯酸 (EET) 和 20-羟基二十碳四烯酸 (20-HETE)。

血压盐敏感性的定义：将下载来自监测器的血压数据，并使用盐负荷当天中午 12 点（盐水输注结束）至晚上 10 点的平均收缩压作为BP 用于研究的盐负荷期。 从中午 12 点（第二次服用呋塞米）到晚上 10 点，减盐当天的平均收缩压将用作减盐研究期间的血压。 从盐负荷到盐消耗期收缩压下降≥10 mm Hg 将被用于将受试者分类为盐敏感。

钠 MRI 成像：研究人员将在范德比尔特成像研究所非侵入性地检测人体组织中的 Na+ 储存。 他们将严格遵守先前报道的方法，通过 23Na MRI 量化皮肤中的 Na+ 含量。6， 37、38。 成像是在 Philips Achieva 3.0T MR 扫描仪（Philips Healthcare，Cleveland OH，USA）和 23Na 正交膝关节线圈（Rapid Biomedical GmbH，Rimpar，德国）上完成的。 研究人员使用校准体模（NaCl 浓度增​​加的水溶液）作为参考标准，并将它们与受试者小腿肌肉的切片一起扫描以进行质量控制。 扫描左小腿（小腿区域最宽的部分），皮肤与模型支架的硬表面紧密接触 3 分 52 秒。 所有成像数据均使用自定义 MATLAB (R2013a) 脚本进行离线处理。 Na+ 量化是通过比较 Na+ 图像上组织模型和校准模型之间的信号强度来进行的。 根据模型数据评估线性关系（Na+ 浓度与信号强度），并将线性回归的结果应用于组织区域以量化 Na+ 含量。

免疫细胞激活研究：研究人员将确定盐敏感性是否与人类单核细胞的激活状态有关。 获得肝素化血样(40ml)并通过Ficoll-梯度分离PBMC。 使用 Miltenyi 单核细胞分离试剂盒通过磁性标记和阴性选择从 PBMC 中分离出单核细胞，并使用流式细胞术进行分析。 他们将单核细胞识别为 CD45+/CD14+ 细胞，并可以进一步检查中间单核细胞 (CD14+/CD16+ 和非经典单核细胞 (CD14-/CD16+)。 CD14+/CD16+ 细胞占循环的约 10%，特别令人感兴趣，它们会产生更高水平的 TNFalpha 并促进 T 细胞活化。 这些在患有高血压的人中增加并且响应于体外升高的Na +暴露。 尽管 DC 的亚型在数量上相对较少，但研究人员将通过测量 CD45+/CD1c+、CD45+/CD141+、CD45+/CD209+、CD45+/CD83+ 和最近发现的 Axl/SICLEC6 细胞对其进行量化。 7-AAD 用于排除死细胞。 将使用单链抗体 D-11 进行细胞内染色以检测 IsoLG 蛋白加合物。 将测量 CD80 和 CD86 的表面表达，它们在成熟的抗原呈递细胞上表达，允许它们参与 T 细胞共刺激。 通过流式细胞仪对其他炎症细胞的外周血单核细胞进行一般表征，包括总白细胞（CD45+ 细胞）、B 细胞（CD45+/CD19+）、总 T 细胞（CD45+/CD3+ 细胞）和 T 细胞亚型（CD3+/CD8+ 和还将执行 CD4+) 细胞。 这些实验将在新鲜分离的细胞和暴露于正常盐或高盐 48 小时的单核细胞中进行，以确定盐敏感性是否反映在单核细胞中，如图 2 所示。来自培养 48 小时的单核细胞的培养基是使用 luminex 分析细胞因子释放，包括 IL-1 β、TNF-α、IL-6 和 IL-23。 研究人员还将获得血浆以评估细胞因子，包括负责将单核细胞转化为 DC 的 GM-CSF、IL-4 和 Flt3 配体。 为确保可重复性，样本将提交给范德比尔特内分泌学和新陈代谢核心设施以进行盲法 Luminex 分析。 O2·- 的产生和 NADPH 氧化酶的激活的测量，包括 p47phox 的磷酸化和 p47phox 与 gp91phox 的结合，通过免疫沉淀和免疫印迹在基线和响应升高的 Na+ 上进行，如前所述。