Saltfølsomhet og immunitetscelleaktivering

Etterforskerne vil bruke Weinberger-protokollen på 20 pasienter som tidligere rapportert. De vil råde deltakerne til å opprettholde sitt vanlige kosthold og saltforbruk frem til utbruddet av protokollen og gi dem en beholder og passende instruksjoner for å ta en 24-timers urinprøve dagen før innleggelse til sykehuset. Innleggelse vil finne sted to uker senere, for utvasking av effekten av medisinene, og på en kveld, for at pasienten skal hvile over natten på sykehuset før protokollen starter. I løpet av disse to ukene vil ubehandlet blodtrykk bli overvåket enten av pasientene hjemme eller ved midlertidige planlagte besøk, for å sikre at det ikke overstiger 180/110 mmHg, i så fall vil protokollen avbrytes for sikkerhets skyld. Ved innleggelse vil volumet av baseline-urinen bli målt, og alikvoter sendes til laboratoriet eller fryses ved -800C for forskningsanalytter. Om morgenen etter innleggelse (06.00) vil en ambulerende blodtrykksmåler (SpaceLabs 90207 eller 90210) settes opp for kontinuerlig blodtrykksregistrering gjennom hele studien (hvert 15. minutt fra kl. 06.00 til kl. 22.00 og hvert 30. minutt fra kl. 22.00 til kl. 06.00), vil kroppsvekten registreres med pasienten iført kjole (samme skala som fremtidige dager), blodprøver vil bli tatt for analyttene fra studien beskrevet nedenfor (grunnlinjetester), og en ny 24-timers samling vil bli tatt. startet for perioden med saltlasting kl. 8.00. Saltbelastning vil oppnås ved kombinasjonen av en diett med høyt saltinnhold (isokalorisk, med 160 mEq Na og 70 mEq K), som pasienten vil innta i sin helhet, og en infusjon av 2L saltvann (300 mEq Na+). Pasienter vil ha fri tilgang til vann, men maten vil være begrenset til det som er gitt av protokollen. De legger seg klokken 22.00. Neste morgen (06.00) vil kroppsvekt og blodprøver igjen bli tatt, og den 24-timers innsamlingen vil bli fullført med en forsettlig tømming kl. 8.00. Disse laboratoriedataene vil gjenspeile effekten av saltbelastning. Klokken 08.00 vil forsøkspersonene bli utsatt for saltmangel. Dette oppnås ved å administrere en isokalorisk diett som inneholder 10 mEq Na og 70 mEq K og fortsatt ubegrenset vanninntak. Kl. 08.00, 12.00 og 16.00 vil forsøkspersonene få 40 mg furosemid oralt. En ytterligere 12-timers urinsamling vil bli startet kl. 08.00 og avsluttet med et forsettlig tomrom kl. 20.00 (som gjenspeiler perioden med furosemid-natriurese). En ny 12-timers samling starter kl. 20.00, og stenges med forsettlig tømming neste morgen kl. 8.00 (som gjenspeiler perioden med saltmangel). Neste morgen (06.00) vil siste registrering av kroppsvekt og blodprøvetaking finne sted, og innen kl. 08.00 vil den 12-timers urininnsamlingen for perioden med saltmangel være fullført. Pasientene vil få frokost fra vanlig sykehuskost, som kan suppleres med salt mat eller væske dersom saltmangelinngrepet ga svimmelhet eller dokumentert ortostase. Når pasienten er stabil og viser toleranse for oppreist stilling, vil han/hun bli utskrevet hjem med instruksjoner om å gjenoppta antihypertensive medisiner, med mindre tilstedeværelsen av ortostase krever en modifikasjon i regimet, som vil bli informert av en lege som er medlem av forskningen. team.

Laboratorieblodmålinger: Tester som skal utføres i de 3 daglige settene med blodprøver vil inkludere; CBC og rutinekjemi (inkludert serumkreatinin, Na+ og K+) ved sentrallaboratoriet til VUMC; Plasma-reninaktivitet ved radioimmunoassay; Plasma-aldosteron ved radioimmunoassay; Plasma eicosatrienoic syrer (EETs) og 20-hydroxyeicosatetraenoic acid (20-HETE) ved eicosanoid kjernen av VUMC ved væskekromatografi / tandem massespektrometri.

Urinalyse: Tester som skal utføres i de 4 urinprøvene (24-timers baseline, 24-timers saltbelastning, 12-timers furosemid-natriurese og 12-timers saltmangel) vil inkludere; Na+, K+ og kreatininkonsentrasjon ved sentrallaboratoriet til VUMC; Urin eicosatrienoic syrer (EETs) og 20-hydroxyeicosatetraenoic acid (20-HETE) ved eicosanoid kjernen av VUMC ved væskekromatografi/tandem massespektrometri.

Definisjon av saltfølsomhet for blodtrykk: Blodtrykksdata fra monitorene vil bli lastet ned, og gjennomsnittet av det systoliske blodtrykket på dagen for saltinnlasting, fra kl. 12.00 (slutten av saltvannsinfusjonen) til kl. 22.00 vil bli brukt som BP for studietiden for saltlasting. Gjennomsnittet av det systoliske blodtrykket på dagen for saltmangel, fra kl. 12.00 (andre dose furosemid) til kl. 22.00 vil bli brukt som BP for den saltfattige studieperioden. Et fall i systolisk BP ≥10 mm Hg fra saltbelastningsperioden til saltdeplesjonsperioden vil bli brukt til å klassifisere et individ som saltsensitivt.

Natrium MR-avbildning: Etterforskerne vil ikke-invasivt oppdage Na+-lagring i vev hos mennesker ved Vanderbilt bildebehandlingsinstitutt. De vil kvantifisere Na+-innholdet i huden ved hjelp av 23Na MRI med streng overholdelse av tidligere rapporterte tilnærminger.6, 37, 38. Avbildning gjøres på en Philips Achieva 3.0T MR-skanner (Philips Healthcare, Cleveland OH, USA) med en 23Na kvadratur knespole (Rapid Biomedical GmbH, Rimpar, Tyskland). Etterforskerne bruker kalibreringsfantomer (vandige løsninger med økende NaCl-konsentrasjoner) som referansestandarder og skanner dem sammen med snitt gjennom forsøkspersonens leggmuskler for kvalitetskontroll. Venstre underben (den bredeste delen av leggregionen) skannes med huden tett i kontakt med den harde overflaten av fantomholderen i 3 minutter og 52 sekunder. Alle bildedata behandles off-line med tilpassede MATLAB (R2013a) skript. Na+ kvantifisering utføres ved å sammenligne signalintensiteter mellom vev og kalibreringsfantomer på Na+-bildet. Et lineært forhold (Na+-konsentrasjon vs signalintensitet) vurderes basert på fantomdataene, og resultater fra en lineær regresjon brukes på vevsregioner for å kvantifisere Na+-innhold.

Immuncelleaktiveringsstudier: Etterforskerne vil avgjøre om saltfølsomhet er assosiert med aktiveringstilstanden til humane monocytter. Hepariniserte blodprøver (40 ml) oppnås og PBMC-er isoleres med Ficoll-gradient. Monocytter isoleres fra PBMC ved magnetisk merking og negativ seleksjon ved bruk av Miltenyi monocyttisolasjonssett og analysert ved bruk av flowcytometri. De identifiserer monocytter som CD45+/CD14+-celler og kan videre undersøke mellomliggende (CD14+/CD16+ og ikke-klassiske monocytter (CD14-/CD16+). CD14+/CD16+-cellene som utgjør omtrent 10 % av sirkulasjonen, er av spesiell interesse, de produserer økte nivåer av TNFalfa og fremmer T-celleaktivering. Disse øker hos mennesker med hypertensjon og som respons på in vitro forhøyet Na+-eksponering. Selv om undertyper av DC-er er relativt sjeldne i antall, vil etterforskerne kvantifisere dem ved å måle CD45+/CD1c+, CD45+/CD141+, CD45+/CD209+, CD45+/CD83+ og de nylig identifiserte Axl/SICLEC6-cellene. 7-AAD brukes til å ekskludere døde celler. Intracellulær farging med enkeltkjedet antistoff D-11 for å påvise IsoLG-proteinaddukter vil bli brukt. Overflateekspresjon av CD80 og CD86, som uttrykkes på modne antigen-presenterende celler som lar dem delta i T-celle-co-stimulering, vil bli målt. Generell karakterisering av mononukleære celler i perifert blod ved flowcytometri for andre inflammatoriske celler, inkludert totale leukocytter (CD45+-celler), B-celler (CD45+/CD19+), totale T-celler (CD45+/CD3+-celler), og T-cellesubtypen (CD3+/CD8+ og CD4+) celler vil også bli utført. Disse forsøkene vil bli utført i nyisolerte celler og også i monocytter eksponert for normalt salt eller høyt salt i 48 timer for å bestemme om saltfølsomhet gjenspeiles i monocyttene som vist i fig. 2. Medium fra monocytter dyrket i 48 timer er analysert for cytokinfrigjøring inkludert IL-1 beta, TNF-alfa, IL-6 og IL-23 ved bruk av luminex. Etterforskerne vil også skaffe plasma for å vurdere for cytokiner inkludert GM-CSF, IL-4 og Flt3 ligand som er ansvarlige for konvertering av monocytter til DC. For å sikre reproduserbarhet vil prøvene sendes til Vanderbilt Endocrinology and Metabolism Core Facility for å utføre en blindet Luminex-analyse. Målinger av O2·- produksjon og aktivering av NADPH oksidase inkludert fosforylering av p47phox og assosiasjon av p47phox med gp91phox ved immunutfelling og western blot både ved baseline og som respons forhøyet Na+ vil bli gjort tidligere beskrevet.