Zoutgevoeligheid en immuniteitscelactivering

De onderzoekers zullen het Weinberger-protocol gebruiken bij 20 patiënten, zoals eerder gemeld. Zij zullen de deelnemers adviseren om hun gebruikelijke dieet en zoutconsumptie te behouden tot het begin van het protocol en hen een container en passende instructies te geven om de dag voor opname in het ziekenhuis een 24-uurs urinemonster te verzamelen. De opname vindt twee weken later plaats, om het effect van de medicijnen uit te wassen, en op een avond, zodat de patiënt een nacht in het ziekenhuis kan rusten voordat het protocol begint. Gedurende deze twee weken zal de onbehandelde bloeddruk door de patiënten thuis of tijdens tussentijdse geplande bezoeken worden gecontroleerd om er zeker van te zijn dat deze niet hoger wordt dan 180/110 mmHg, in welk geval het protocol voor de veiligheid wordt stopgezet. Bij opname wordt het volume van de basislijnurine gemeten en worden aliquots naar het laboratorium gestuurd of ingevroren bij -80°C voor onderzoeksanalyten. De ochtend na opname (06.00 uur) zal een ambulante bloeddrukmeter (SpaceLabs 90207 of 90210) worden opgesteld voor continue bloeddrukregistratie tijdens het onderzoek (elke 15 minuten van 06.00 uur tot 22.00 uur en elke 30 minuten van 22.00 uur tot 22.00 uur). 06.00 uur), het lichaamsgewicht zal worden geregistreerd terwijl de patiënt een schort draagt ​​(dezelfde schaal als toekomstige dagen), er zullen bloedmonsters worden genomen voor de analyten van het hieronder beschreven onderzoek (basislijntests), en er zal een nieuwe 24-uursafname worden uitgevoerd begonnen voor de periode van zoutbelading om 8 uur. Zoutbelasting wordt bereikt door de combinatie van een zoutrijk dieet (isocalorisch, met 160 mEq Na en 70 mEq K), dat de patiënt in zijn geheel zal consumeren, en een infuus van 2L zoutoplossing (300 mEq Na+). Patiënten zullen gratis toegang hebben tot water, maar hun voedsel zal beperkt zijn tot wat voorzien is in het protocol. Om 22.00 uur gaan ze naar bed. De volgende ochtend (06.00 uur) zullen opnieuw lichaamsgewicht- en bloedmonsters worden genomen en de 24-uursverzameling zal worden voltooid met een opzettelijke mictie om 8.00 uur. Deze laboratoriumgegevens zullen het effect van zoutbelasting weergeven. Om 8 uur worden proefpersonen onderworpen aan zoutuitputting. Dit wordt bereikt door het toedienen van een isocalorisch dieet met 10 mEq Na en 70 mEq K en een continue onbeperkte inname van water. Om 8.00 uur, 12.00 uur en 16.00 uur krijgen proefpersonen oraal 40 mg furosemide. Om 8 uur 's ochtends wordt gestart met een extra urineverzameling van 12 uur en deze wordt om 20 uur beëindigd met een opzettelijke urinelozing (de periode van furosemide-natriurese weerspiegelt). Om 20.00 uur start een nieuwe inzameling van 12 uur, die de volgende ochtend om 8.00 uur wordt afgesloten met opzettelijke lediging (weerspiegeling van de periode van zouttekort). De volgende ochtend (06.00 uur) vindt de laatste gewichtsregistratie en bloedafname plaats en om 08.00 uur is de 12 uur durende urineverzameling voor de periode van zoutdepletie voltooid. De patiënten krijgen een ontbijt van een normaal ziekenhuisdieet, dat kan worden aangevuld met zoute voedingsmiddelen of vloeistoffen als de zoutdepletie-interventie duizeligheid of gedocumenteerde orthostase veroorzaakte. Zodra de patiënt stabiel is en tolerantie vertoont voor de rechtopstaande houding, wordt hij/zij naar huis ontslagen met instructies om de antihypertensiva te hervatten, tenzij de aanwezigheid van orthostase een wijziging in het regime vereist, die zal worden geadviseerd door een arts die lid is van het onderzoek. team.

Laboratoriumbloedmetingen: Tests die moeten worden uitgevoerd in de 3 dagelijkse sets bloedmonsters omvatten; CBC's en routinechemie (waaronder serumcreatinine, Na+ en K+) in het centrale laboratorium van VUMC; Plasma-renine-activiteit door radio-immunoassay; Plasma-aldosteron door middel van radio-immunoassay; Plasma-eicosatrieenzuren (EET's) en 20-hydroxyeicosatetraeenzuur (20-HETE) in de eicosanoïde kern van VUMC door vloeistofchromatografie / tandem massaspectrometrie.

Urineonderzoek: Tests die moeten worden uitgevoerd in de 4 urinemonsters (24 uur basislijn, 24 uur zoutbelasting, 12 uur furosemide natriurese en 12 uur zoutdepletie) omvatten; Na+, K+ en creatinineconcentratie in het centrale laboratorium van VUMC; Urine eicosatrieenzuren (EET's) en 20-hydroxyeicosatetraeenzuur (20-HETE) in de eicosanoïde kern van VUMC door vloeistofchromatografie / tandem massaspectrometrie.

Definitie van zoutgevoeligheid van bloeddruk: bloeddrukgegevens van de monitoren worden gedownload en het gemiddelde van de systolische bloeddruk van de dag van zoutinname, van 12 uur 's middags (einde van de infusie met zoutoplossing) tot 22 uur 's avonds, wordt gebruikt als de BP voor de zoutbeladingsperiode van het onderzoek. Het gemiddelde van de systolische bloeddruk van de dag van zoutdepletie, van 12.00 uur (tweede dosis furosemide) tot 22.00 uur, zal worden gebruikt als de bloeddruk voor de zoutarme studieperiode. Een daling van de systolische bloeddruk ≥10 mm Hg van de zoutbelasting tot de zoutdepletieperiodes zal worden gebruikt om een ​​proefpersoon als zoutgevoelig te classificeren.

Natrium-MRI-beeldvorming: de onderzoekers zullen niet-invasief Na+-opslag in weefsels van mensen detecteren bij het Vanderbilt Imaging Institute. Ze zullen het Na+-gehalte in de huid kwantificeren met behulp van 23Na MRI, waarbij nauwgezet wordt vastgehouden aan eerder gerapporteerde benaderingen.6, 37, 38. Beeldvorming wordt gedaan op een Philips Achieva 3.0T MR-scanner (Philips Healthcare, Cleveland OH, VS) met een 23Na kwadratuur kniespoel (Rapid Biomedical GmbH, Rimpar, Duitsland). De onderzoekers gebruiken kalibratiefantomen (waterige oplossingen met toenemende NaCl-concentraties) als referentiestandaarden en scannen ze samen met secties door de kuitspieren van de proefpersoon voor kwaliteitscontrole. Het linker onderbeen (het breedste deel van de kuit) wordt gescand met de huid nauw in contact met het harde oppervlak van de fantoomhouder gedurende 3 minuten en 52 seconden. Alle beeldgegevens worden offline verwerkt met aangepaste MATLAB (R2013a)-scripts. Na+-kwantificering wordt uitgevoerd door signaalintensiteiten tussen weefsel en kalibratiefantomen op het Na+-beeld te vergelijken. Een lineaire relatie (Na+-concentratie versus signaalintensiteit) wordt beoordeeld op basis van de fantoomgegevens, en de resultaten van een lineaire regressie worden toegepast op weefselgebieden om het Na+-gehalte te kwantificeren.

Immuuncelactiveringsstudies: de onderzoekers zullen bepalen of zoutgevoeligheid verband houdt met de activeringstoestand van menselijke monocyten. Gehepariniseerde bloedmonsters (40 ml) worden verkregen en PBMC's worden geïsoleerd met Ficoll-gradiënt. Monocyten worden geïsoleerd uit de PBMC door magnetische labeling en negatieve selectie met behulp van de Miltenyi monocyt-isolatiekit en geanalyseerd met behulp van flowcytometrie. Ze identificeren monocyten als CD45+/CD14+-cellen en kunnen intermediaire (CD14+/CD16+ en niet-klassieke monocyten (CD14-/CD16+) verder onderzoeken. De CD14+/CD16+-cellen die ongeveer 10% van de circulatie uitmaken, zijn van bijzonder belang, ze produceren verhoogde niveaus van TNFalfa en bevorderen T-celactivering. Deze zijn verhoogd bij mensen met hypertensie en als reactie op in vitro verhoogde blootstelling aan Na+. Hoewel subtypes van DC's relatief zeldzaam in aantal zijn, zullen de onderzoekers ze kwantificeren door CD45+/CD1c+, CD45+/CD141+, CD45+/CD209+, CD45+/CD83+ en de recent geïdentificeerde Axl/SICLEC6-cellen te meten. 7-AAD wordt gebruikt om dode cellen uit te sluiten. Er zal intracellulaire kleuring met het D-11-antilichaam met enkele keten worden gebruikt om IsoLG-eiwitadducten te detecteren. Oppervlakte-expressie van CD80 en CD86, die tot expressie worden gebracht op rijpe antigeenpresenterende cellen waardoor ze kunnen deelnemen aan co-stimulatie van T-cellen, zal worden gemeten. Algemene karakterisering van perifere mononucleaire bloedcellen door flowcytometrie voor andere ontstekingscellen, waaronder totale leukocyten (CD45+-cellen), B-cellen (CD45+/CD19+), totale T-cellen (CD45+/CD3+-cellen) en het T-celsubtype (CD3+/CD8+ en CD4+) cellen zullen ook uitgevoerd worden. Deze experimenten zullen worden uitgevoerd in vers geïsoleerde cellen en ook in monocyten die gedurende 48 uur zijn blootgesteld aan normaal zout of hoog zout om te bepalen of zoutgevoeligheid wordt weerspiegeld in de monocyten, zoals weergegeven in Fig. 2. Medium van monocyten die gedurende 48 uur zijn gekweekt, wordt geanalyseerd op cytokine-afgifte inclusief IL-1 beta, TNF-alpha, IL-6 en IL-23 met behulp van luminex. De onderzoekers zullen ook plasma verkrijgen om te beoordelen op cytokines, waaronder GM-CSF, IL-4 en Flt3-ligand die verantwoordelijk zijn voor de omzetting van monocyten in DC's. Om reproduceerbaarheid te garanderen, zullen de monsters worden ingediend bij de Vanderbilt Endocrinology and Metabolism Core Facility om een ​​geblindeerde Luminex-analyse uit te voeren. Metingen van de O2-productie en activatie van NADPH-oxidase inclusief fosforylering van p47phox en associatie van p47phox met gp91phox door immunoprecipitatie en Western-blot, zowel bij baseline als als reactie verhoogd Na+ zullen eerder beschreven worden gedaan.