Salzempfindlichkeit und Aktivierung der Immunzellen

Wie bereits berichtet, werden die Prüfärzte das Weinberger-Protokoll bei 20 Patienten anwenden. Sie werden den Teilnehmern raten, ihre übliche Ernährung und ihren Salzkonsum bis zum Beginn des Protokolls beizubehalten, und ihnen einen Behälter und entsprechende Anweisungen zur Entnahme einer 24-Stunden-Urinprobe am Tag vor der Aufnahme in das Krankenhaus zur Verfügung stellen. Die Aufnahme erfolgt zwei Wochen später, um die Wirkung der Medikamente auszuwaschen, und an einem Abend, damit der Patient vor Beginn des Protokolls über Nacht im Krankenhaus ruhen kann. Während dieser zwei Wochen wird der unbehandelte Blutdruck entweder von den Patienten zu Hause oder bei zwischenzeitlich geplanten Besuchen überwacht, um sicherzustellen, dass er 180/110 mmHg nicht überschreitet. In diesem Fall wird das Protokoll aus Sicherheitsgründen abgebrochen. Bei der Aufnahme wird das Volumen des Ausgangsurins gemessen und Aliquots an das Labor geschickt oder für Forschungsanalyten bei -800 ° C eingefroren. Am Morgen nach der Aufnahme (6 Uhr) wird ein ambulantes Blutdruckmessgerät (SpaceLabs 90207 oder 90210) zur kontinuierlichen Blutdruckaufzeichnung während der gesamten Studie (alle 15 Minuten von 6 Uhr bis 22 Uhr und alle 30 Minuten von 22 Uhr bis 24 Uhr) eingerichtet 06:00 Uhr), das Körpergewicht wird aufgezeichnet, während der Patient einen Kittel trägt (gleiche Skala wie zukünftige Tage), Blutproben werden für die Analyten der unten beschriebenen Studie entnommen (Baseline-Tests) und eine neue 24-Stunden-Sammlung wird durchgeführt um 8 Uhr morgens für die Zeit der Salzverladung begonnen. Die Salzladung wird durch die Kombination einer salzreichen Diät (isokalorisch, mit 160 mEq Na und 70 mEq K), die der Patient vollständig zu sich nimmt, und einer Infusion von 2 l Kochsalzlösung (300 mEq Na+) erreicht. Die Patienten haben freien Zugang zu Wasser, ihre Nahrung ist jedoch auf die im Protokoll vorgesehene beschränkt. Sie gehen um 22 Uhr ins Bett. Am nächsten Morgen (6.00 Uhr) werden erneut Körpergewicht und Blutproben entnommen, und die 24-Stunden-Sammlung wird mit einer beabsichtigten Entleerung um 8.00 Uhr abgeschlossen. Diese Labordaten spiegeln die Wirkung der Salzbeladung wieder. Um 8:00 Uhr werden die Probanden einer Salzverarmung unterzogen. Dies wird durch Verabreichung einer isokalorischen Diät mit 10 mEq Na und 70 mEq K und fortgesetzter unbegrenzter Wasseraufnahme erreicht. Um 8:00 Uhr, 12:00 Uhr und 16:00 Uhr werden den Probanden 40 mg Furosemid oral verabreicht. Eine zusätzliche 12-stündige Urinsammlung wird um 8:00 Uhr begonnen und mit einer absichtlichen Entleerung um 20:00 Uhr beendet (was den Zeitraum der Furosemid-Natriurese widerspiegelt). Eine neue 12-Stunden-Sammlung beginnt um 20:00 Uhr und wird am nächsten Morgen um 8:00 Uhr mit absichtlicher Entleerung geschlossen (was die Zeit des Salzabbaus widerspiegelt). Am nächsten Morgen (6.00 Uhr) erfolgt die letzte Körpergewichtserfassung und Blutabnahme, bis 8.00 Uhr ist die 12-Stunden-Urinsammlung für die Zeit des Salzabbaus abgeschlossen. Die Patienten erhalten ein Frühstück aus einer normalen Krankenhausdiät, das durch salzige Speisen oder Flüssigkeiten ergänzt werden kann, wenn die Intervention zum Salzabbau zu Schwindel oder dokumentierter Orthostase geführt hat. Sobald der Patient stabil ist und die aufrechte Haltung toleriert, wird er/sie mit Anweisungen zur Wiederaufnahme der antihypertensiven Medikation nach Hause entlassen, es sei denn, das Vorhandensein von Orthostase erfordert eine Änderung des Regimes, die von einem an der Forschung beteiligten Arzt empfohlen wird Team.

Laborblutmessungen: Die Tests, die in den 3 täglichen Sätzen von Blutproben durchgeführt werden, umfassen: CBCs und Routinechemie (einschließlich Serumkreatinin, Na+ und K+) im Zentrallabor des VUMC; Plasma-Renin-Aktivität durch Radioimmunoassay; Plasma-Aldosteron durch Radioimmunoassay; Plasma-Eicosatriensäuren (EETs) und 20-Hydroxyeicosatetraensäure (20-HETE) am Eicosanoid-Kern von VUMC durch Flüssigchromatographie/Tandem-Massenspektrometrie.

Urinanalyse: Die in den 4 Urinproben durchzuführenden Tests (24-Stunden-Grundlinie, 24-Stunden-Salzbeladung, 12-Stunden-Furosemid-Natriurese und 12-Stunden-Salzabbau) umfassen: Na+, K+ und Kreatininkonzentration im Zentrallabor des VUMC; Urin-Eicosatriensäuren (EETs) und 20-Hydroxyeicosatetraensäure (20-HETE) am Eicosanoid-Kern von VUMC durch Flüssigchromatographie/Tandem-Massenspektrometrie.

Definition der Salzempfindlichkeit des Blutdrucks: Blutdruckdaten von den Monitoren werden heruntergeladen und der Durchschnitt des systolischen Blutdrucks des Tages der Salzbelastung von 12:00 Uhr (Ende der Kochsalzinfusion) bis 22:00 Uhr wird als verwendet BP für den Studienzeitraum mit Salzbelastung. Der durchschnittliche systolische Blutdruck des Tages des Salzmangels von 12:00 Uhr (zweite Gabe von Furosemid) bis 22:00 Uhr wird als Blutdruck für die salzarme Studienperiode verwendet. Ein Abfall des systolischen Blutdrucks um ≥ 10 mmHg von der Salzbelastung bis zu den Salzmangelperioden wird verwendet, um eine Person als salzempfindlich zu klassifizieren.

Natrium-MRT-Bildgebung: Die Forscher werden am Vanderbilt Imaging Institute die Na+-Speicherung im menschlichen Gewebe nicht-invasiv nachweisen. Sie werden den Na+-Gehalt in der Haut durch 23Na-MRT unter rigoroser Einhaltung zuvor berichteter Ansätze quantifizieren.6, 37, 38. Die Bildgebung erfolgt auf einem Philips Achieva 3.0T MR-Scanner (Philips Healthcare, Cleveland OH, USA) mit einer 23Na-Quadratur-Kniespule (Rapid Biomedical GmbH, Rimpar, Deutschland). Die Prüfer verwenden Kalibrierphantome (wässrige Lösungen mit steigender NaCl-Konzentration) als Referenzstandards und scannen sie zusammen mit Schnitten durch die Wadenmuskulatur des Probanden zur Qualitätskontrolle. Der linke Unterschenkel (der breiteste Teil der Wadenregion) wird gescannt, wobei die Haut 3 Minuten und 52 Sekunden lang eng an der harten Oberfläche des Phantomhalters anliegt. Alle Bilddaten werden offline mit benutzerdefinierten MATLAB (R2013a)-Skripten verarbeitet. Die Na+-Quantifizierung erfolgt durch Vergleich der Signalintensitäten zwischen Gewebe- und Kalibrierungsphantomen auf dem Na+-Bild. Basierend auf den Phantomdaten wird eine lineare Beziehung (Na+-Konzentration vs. Signalintensität) ermittelt, und die Ergebnisse einer linearen Regression werden auf Geweberegionen angewendet, um den Na+-Gehalt zu quantifizieren.

Studien zur Aktivierung von Immunzellen: Die Forscher werden feststellen, ob die Salzempfindlichkeit mit dem Aktivierungszustand menschlicher Monozyten zusammenhängt. Heparinisierte Blutproben (40 ml) werden erhalten und PBMCs werden durch Ficoll-Gradienten isoliert. Monozyten werden aus den PBMC durch magnetische Markierung und negative Selektion unter Verwendung des Miltenyi-Monozyten-Isolierungskits isoliert und unter Verwendung von Durchflusszytometrie analysiert. Sie identifizieren Monozyten als CD45+/CD14+ Zellen und können intermediäre (CD14+/CD16+ und nicht-klassische Monozyten (CD14-/CD16+) weiter untersuchen. Von besonderem Interesse sind die CD14+/CD16+-Zellen, die etwa 10 % der Zirkulation ausmachen. Sie produzieren erhöhte TNFalpha-Spiegel und fördern die T-Zell-Aktivierung. Diese sind bei Menschen mit Bluthochdruck und als Reaktion auf eine in vitro erhöhte Na+-Exposition erhöht. Obwohl Subtypen von DCs relativ selten sind, werden die Forscher sie quantifizieren, indem sie CD45+/CD1c+, CD45+/CD141+, CD45+/CD209+, CD45+/CD83+ und die kürzlich identifizierten Axl/SICLEC6-Zellen messen. 7-AAD wird verwendet, um tote Zellen auszuschließen. Es wird eine intrazelluläre Färbung mit dem Single-Chain-Antikörper D-11 zum Nachweis von IsoLG-Proteinaddukten verwendet. Die Oberflächenexpression von CD80 und CD86, die auf reifen Antigen-präsentierenden Zellen exprimiert werden, die es ihnen ermöglichen, an der Co-Stimulation von T-Zellen teilzunehmen, wird gemessen. Allgemeine Charakterisierung peripherer mononukleärer Blutzellen durch Durchflusszytometrie für andere Entzündungszellen, einschließlich Gesamtleukozyten (CD45+-Zellen), B-Zellen (CD45+/CD19+), Gesamt-T-Zellen (CD45+/CD3+-Zellen) und des T-Zell-Subtyps (CD3+/CD8+ und CD4+)-Zellen werden ebenfalls durchgeführt. Diese Experimente werden in frisch isolierten Zellen und auch in Monozyten durchgeführt, die 48 Stunden lang normalem Salz oder hohem Salzgehalt ausgesetzt wurden, um zu bestimmen, ob sich die Salzempfindlichkeit in den Monozyten widerspiegelt, wie in 2 gezeigt. Medium aus 48 Stunden lang kultivierten Monozyten ist mit Luminex auf Zytokinfreisetzung einschließlich IL-1 beta, TNF-alpha, IL-6 und IL-23 analysiert. Die Ermittler werden auch Plasma erhalten, um es auf Zytokine einschließlich GM-CSF, IL-4 und Flt3-Liganden zu untersuchen, die für die Umwandlung von Monozyten in DCs verantwortlich sind. Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, werden die Proben an die Vanderbilt Endocrinology and Metabolism Core Facility geschickt, um eine verblindete Luminex-Analyse durchzuführen. Messungen der O2·--Produktion und Aktivierung von NADPH-Oxidase, einschließlich Phosphorylierung von p47phox und Assoziation von p47phox mit gp91phox durch Immunpräzipitation und Western-Blot sowohl zu Beginn als auch als Reaktion auf erhöhtes Na+ werden wie zuvor beschrieben durchgeführt.