Saltfølsomhed og immunitetscelleaktivering

Efterforskerne vil anvende Weinberger-protokollen i 20 patienter som tidligere rapporteret. De vil råde deltagerne til at opretholde deres sædvanlige kost og saltforbrug indtil protokollens begyndelse og give dem en beholder og passende instruktioner til at tage en 24-timers urinprøve dagen før indlæggelse på hospitalet. Indlæggelse vil finde sted to uger senere, for udvaskning af virkningen af ​​medicinen, og en aften, for at patienten kan hvile natten over på hospitalet, inden protokollen begynder. I løbet af disse to uger vil ubehandlet blodtryk blive monitoreret enten af ​​patienterne i hjemmet eller ved midlertidige planlagte besøg for at sikre, at det ikke overstiger 180/110 mmHg, i hvilket tilfælde protokollen afbrydes for sikkerheds skyld. Ved indlæggelsen vil volumen af ​​baseline-urinen blive målt, og alikvoter sendt til laboratoriet eller frosset ved -800°C til forskningsanalytter. Om morgenen efter indlæggelsen (6.00) vil en ambulant blodtryksmåler (SpaceLabs 90207 eller 90210) blive sat op til kontinuerlig blodtryksregistrering under hele undersøgelsen (hvert 15. minut fra kl. 06.00 til kl. 22.00 og hvert 30. minut fra kl. 6 om morgenen), vil kropsvægten blive registreret med patienten iført en kjole (samme skala som fremtidige dage), blodprøver vil blive udtaget for analytterne fra undersøgelsen beskrevet nedenfor (baseline-tests), og en ny 24-timers samling vil blive startede for perioden med saltladning kl. 8.00. Saltbelastning vil blive opnået ved kombinationen af ​​en kost med højt saltindhold (isokalorisk, med 160 mEq Na og 70 mEq K), som patienten indtager i sin helhed, og en infusion af 2L saltvand (300 mEq Na+). Patienter vil have fri adgang til vand, men deres mad vil være begrænset til det, protokollen giver. De går i seng kl. 22.00. Den følgende morgen (06.00) vil der igen blive taget kropsvægt og blodprøver, og 24-timers indsamlingen vil blive afsluttet med en bevidst tømning kl. 8.00. Disse laboratoriedata vil afspejle effekten af ​​saltbelastning. 8.00 vil forsøgspersoner blive udsat for saltmangel. Dette opnås ved at administrere en isokalorisk diæt indeholdende 10 mEq Na og 70 mEq K og fortsat ubegrænset vandindtagelse. 8.00, 12.00 og 16.00 vil forsøgspersonerne få 40 mg furosemid oralt. En yderligere 12-timers urinopsamling vil blive påbegyndt kl. 8.00 og afsluttet med et bevidst tomrum kl. 20.00 (som afspejler perioden med furosemid-natriurese). En ny 12-timers indsamling starter kl. 20.00 og lukkes med forsætlig tømning næste morgen kl. 8.00 (som afspejler perioden med saltnedbrydning). Næste morgen (6.00) vil den sidste registrering af kropsvægt og udtagning af blodprøver finde sted, og kl. 8.00 vil den 12-timers urinopsamling for perioden med saltmangel være afsluttet. Patienterne vil få morgenmad fra en almindelig hospitalsdiæt, som kan suppleres med salt mad eller væske, hvis saltnedbrydningsindgrebet gav svimmelhed eller dokumenterede ortostase. Når patienten er stabil og udviser tolerance over for den oprejste stilling, vil han/hun blive udskrevet hjem med instruktioner om at genoptage antihypertensiv medicin, medmindre tilstedeværelsen af ​​ortostase kræver en ændring i kuren, som vil blive rådgivet af en læge, der er medlem af forskningen. hold.

Laboratorieblodmålinger: Tests, der skal udføres i de 3 daglige sæt blodprøver vil omfatte; CBC'er og rutinekemi (herunder serumkreatinin, Na+ og K+) ved VUMC's centrale laboratorium; Plasma-reninaktivitet ved radioimmunoassay; Plasma-aldosteron ved radioimmunoassay; Plasma eicosatriensyrer (EET'er) og 20-hydroxyeicosatetraensyre (20-HETE) ved eicosanoid kerne af VUMC ved væskekromatografi/tandem massespektrometri.

Urinalyse: Tests, der skal udføres i de 4 urinprøver (24-timers baseline, 24-timers saltpåfyldning, 12-timers furosemid-natriurese og 12-timers saltudtømning) vil omfatte; Na+-, K+- og kreatininkoncentration i VUMC's centrale laboratorium; Urin eicosatriensyrer (EET'er) og 20-hydroxyeicosatetraensyre (20-HETE) ved eicosanoid kerne af VUMC ved væskekromatografi/tandem massespektrometri.

Definition af saltfølsomhed for blodtryk: Blodtryksdata fra monitorerne vil blive downloadet, og gennemsnittet af det systoliske blodtryk på dagen for saltpåfyldning, fra kl. 12.00 (afslutningen af ​​saltvandsinfusionen) til kl. BP for undersøgelsesperioden for saltladning. Gennemsnittet af det systoliske blodtryk på dagen for saltudtømning, fra kl. 12.00 (anden dosis furosemid) til kl. 22.00 vil blive brugt som BP for den saltfattige undersøgelsesperiode. Et fald i systolisk BP ≥10 mm Hg fra saltbelastningsperioden til saltnedbrydningsperioden vil blive brugt til at klassificere et individ som saltfølsomt.

Natrium-MR-billeddannelse: Efterforskerne vil non-invasivt detektere Na+-lagring i væv fra mennesker på Vanderbilt billedbehandlingsinstitut. De vil kvantificere Na+-indholdet i huden ved hjælp af 23Na MRI med streng overholdelse af tidligere rapporterede metoder.6, 37, 38. Billeddannelse udføres på en Philips Achieva 3.0T MR-scanner (Philips Healthcare, Cleveland OH, USA) med en 23Na kvadratur knæspole (Rapid Biomedical GmbH, Rimpar, Tyskland). Efterforskerne bruger kalibreringsfantomer (vandige opløsninger med stigende NaCl-koncentrationer) som referencestandarder og scanner dem sammen med snit gennem forsøgspersonens lægmuskler til kvalitetskontrol. Det venstre underben (den bredeste del af lægregionen) scannes med huden tæt i kontakt med den hårde overflade af fantomholderen i 3 minutter og 52 sekunder. Alle billeddata behandles off-line med brugerdefinerede MATLAB (R2013a) scripts. Na+ kvantificering udføres ved at sammenligne signalintensiteter mellem væv og kalibreringsfantomer på Na+ billedet. Et lineært forhold (Na+-koncentration vs. signalintensitet) vurderes baseret på fantomdataene, og resultater fra en lineær regression anvendes på vævsregioner for at kvantificere Na+-indholdet.

Immuncelleaktiveringsundersøgelser: Efterforskerne vil afgøre, om saltfølsomhed er forbundet med aktiveringstilstanden af ​​humane monocytter. Hepariniserede blodprøver (40 ml) opnås, og PBMC'er isoleres ved Ficoll-gradient. Monocytter isoleres fra PBMC ved magnetisk mærkning og negativ selektion ved hjælp af Miltenyi monocytisoleringskittet og analyseres ved hjælp af flowcytometri. De identificerer monocytter som CD45+/CD14+-celler og kan yderligere undersøge mellemliggende (CD14+/CD16+ og ikke-klassiske monocytter (CD14-/CD16+). CD14+/CD16+-cellerne, som udgør ca. 10% af cirkulationen, er af særlig interesse, de producerer øgede niveauer af TNFalpha og fremmer T-celleaktivering. Disse er øget hos mennesker med hypertension og som reaktion på in vitro forhøjet Na+-eksponering. Selvom undertyper af DC'er er relativt sjældne i antal, vil efterforskerne kvantificere dem ved at måle CD45+/CD1c+, CD45+/CD141+, CD45+/CD209+, CD45+/CD83+ og de nyligt identificerede Axl/SICLEC6-celler. 7-AAD bruges til at udelukke døde celler. Intracellulær farvning med enkeltkædet antistof D-11 til påvisning af IsoLG-proteinaddukter vil blive anvendt. Overfladeekspression af CD80 og CD86, som udtrykkes på modne antigen-præsenterende celler, hvilket gør det muligt for dem at deltage i T-celle-co-stimulering, vil blive målt. Generel karakterisering af perifere blodmononukleære celler ved flowcytometri for andre inflammatoriske celler, herunder totale leukocytter (CD45+-celler), B-celler (CD45+/CD19+), totale T-celler (CD45+/CD3+-celler) og T-celleundertypen (CD3+/CD8+ og CD4+) celler vil også blive udført. Disse eksperimenter vil blive udført i friskisolerede celler og også i monocytter udsat for normalt salt eller højt saltindhold i 48 timer for at bestemme, om saltfølsomhed afspejles i monocytter som vist i fig. 2. Medium fra monocytter dyrket i 48 timer er analyseret for cytokinfrigivelse, herunder IL-1 beta, TNF-alpha, IL-6 og IL-23 under anvendelse af luminex. Efterforskerne vil også få plasma til at vurdere for cytokiner, herunder GM-CSF, IL-4 og Flt3 ligand, der er ansvarlige for omdannelse af monocytter til DC'er. For at sikre reproducerbarhed vil prøverne blive sendt til Vanderbilt Endocrinology and Metabolism Core Facility for at udføre en blindet Luminex-analyse. Målinger af O2·- produktion og aktivering af NADPH oxidase inklusive phosphorylering af p47phox og association af p47phox med gp91phox ved immunpræcipitation og western blot både ved baseline og som respons forhøjet Na+ vil blive udført tidligere beskrevet.