Sensibilité au sel et activation des cellules immunitaires

Les enquêteurs emploieront le protocole de Weinberger chez 20 patients, comme indiqué précédemment. Ils conseilleront aux participants de maintenir leur régime alimentaire et leur consommation de sel habituels jusqu'au début du protocole et leur fourniront un récipient et des instructions appropriées pour prélever un échantillon d'urine de 24 heures la veille de l'admission à l'hôpital. L'admission aura lieu deux semaines plus tard, pour le lavage de l'effet des médicaments, et un soir, pour que le patient se repose une nuit à l'hôpital avant le début du protocole. Pendant ces deux semaines, la pression artérielle non traitée sera surveillée soit par les patients à domicile, soit lors de visites intermédiaires programmées, pour s'assurer qu'elle ne dépasse pas 180/110 mmHg, auquel cas le protocole sera interrompu pour des raisons de sécurité. Lors de l'admission, le volume de l'urine de référence sera mesuré et des aliquotes envoyées au laboratoire ou congelées à -80°C pour les analytes de recherche. Le matin suivant l'admission (6 h 00), un tensiomètre ambulatoire (SpaceLabs 90207 ou 90210) sera mis en place pour enregistrer la pression artérielle en continu tout au long de l'étude (toutes les 15 minutes de 6 h 00 à 22 h00 et toutes les 30 minutes de 22 h00 à 6 heures du matin), le poids corporel sera enregistré avec le patient portant une blouse (même échelle que les jours futurs), des échantillons de sang seront obtenus pour les analytes de l'étude décrite ci-dessous (tests de base), et une nouvelle collecte de 24 heures sera commencé pour la période de chargement de sel à 8 heures. La charge en sel sera réalisée par l'association d'un régime hypersodé (isocalorique, avec 160 mEq Na et 70 mEq K), que le patient consommera dans son intégralité, et d'une infusion de 2L de sérum physiologique (300 mEq Na+). Les patients auront un accès gratuit à l'eau mais leur alimentation sera limitée à celle prévue par le protocole. Ils se coucheront à 22 heures. Le lendemain matin (6h00), des échantillons de poids corporel et de sang seront à nouveau prélevés, et la collecte de 24 heures sera complétée par une miction intentionnelle à 8h00. Ces données de laboratoire refléteront l'effet de la charge en sel. A 8 heures du matin, les sujets seront soumis à une déplétion en sel. Ceci est accompli en administrant un régime isocalorique contenant 10 mEq Na et 70 mEq K et un apport continu en eau illimité. A 8 h, 12 h et 16 h, les sujets recevront 40 mg de furosémide par voie orale. Une collecte d'urine supplémentaire de 12 heures débutera à 8 h 00 et se terminera par une miction intentionnelle à 20 h 00 (reflétant la période de natriurèse du furosémide). Une nouvelle collecte de 12 heures commencera à 20 h, pour être clôturée avec évacuation volontaire le lendemain matin à 8 h (reflétant la période d'appauvrissement en sel). Le lendemain matin (6h00), le dernier enregistrement du poids corporel et le prélèvement d'échantillons sanguins auront lieu, et à 8h00, la collecte d'urine de 12 heures pour la période de déplétion en sel sera terminée. Les patients recevront un petit-déjeuner à partir d'un régime hospitalier régulier, qui peut être complété par des aliments ou des liquides salés si l'intervention de déplétion en sel a provoqué des étourdissements ou une orthostasie documentée. Une fois que le patient est stable et montre une tolérance à la posture verticale, il sera renvoyé chez lui avec des instructions pour reprendre les médicaments antihypertenseurs, sauf si la présence d'orthostase nécessite une modification du régime, qui sera conseillée par un médecin membre de la recherche. équipe.

Mesures de sang en laboratoire : les tests à effectuer dans les 3 ensembles quotidiens d'échantillons de sang comprendront ; CBC et chimies de routine (y compris créatinine sérique, Na + et K +) au laboratoire central de VUMC ; Activité rénine plasmatique par radio-immunodosage ; Aldostérone plasmatique par radio-immunodosage ; Acides eicosatriénoïques plasmatiques (EET) et acide 20-hydroxyeicosatétraénoïque (20-HETE) au cœur des eicosanoïdes de VUMC par chromatographie liquide/spectrométrie de masse en tandem.

Analyse d'urine : les tests à effectuer dans les 4 échantillons d'urine (ligne de base sur 24 heures, charge en sel sur 24 heures, natriurèse furosémide sur 12 heures et déplétion en sel sur 12 heures) comprendront ; Concentration de Na+, K+ et créatinine au laboratoire central de VUMC ; Acides eicosatriénoïques urinaires (EET) et acide 20-hydroxyeicosatétraénoïque (20-HETE) au cœur des eicosanoïdes de VUMC par chromatographie liquide/spectrométrie de masse en tandem.

Définition de la sensibilité au sel de la pression artérielle : les données de pression artérielle des moniteurs seront téléchargées et la moyenne de la pression artérielle systolique du jour de la charge en sel, de 12 h 00 (fin de la perfusion saline) à 22 h 00 sera utilisée comme BP pour la période d'étude de charge en sel. La moyenne de la pression artérielle systolique du jour de l'appauvrissement en sel, de midi (deuxième dose de furosémide) jusqu'à 22 h, sera utilisée comme TA pour la période d'étude appauvrie en sel. Une chute de la TA systolique ≥ 10 mm Hg entre les périodes de surcharge en sel et les périodes de déplétion en sel sera utilisée pour classer un sujet comme sensible au sel.

Imagerie IRM du sodium : les chercheurs détecteront de manière non invasive le stockage de Na+ dans les tissus humains à l'institut d'imagerie Vanderbilt. Ils quantifieront la teneur en Na + dans la peau par IRM 23Na en respectant rigoureusement les approches précédemment rapportées.6, 37, 38. L'imagerie est réalisée sur un scanner Philips Achieva 3.0T MR (Philips Healthcare, Cleveland OH, USA) avec une bobine de genou en quadrature 23Na (Rapid Biomedical GmbH, Rimpar, Allemagne). Les enquêteurs utilisent des fantômes d'étalonnage (solutions aqueuses avec des concentrations croissantes de NaCl) comme normes de référence et les scannent avec des coupes à travers les muscles du mollet du sujet pour le contrôle de la qualité. Le bas de la jambe gauche (la partie la plus large de la région du mollet) est scanné avec la peau étroitement en contact avec la surface dure du porte-fantôme pendant 3 minutes et 52 secondes. Toutes les données d'imagerie sont traitées hors ligne avec des scripts MATLAB (R2013a) personnalisés. La quantification de Na+ est effectuée en comparant les intensités de signal entre le tissu et les fantômes d'étalonnage sur l'image Na+. Une relation linéaire (concentration de Na + par rapport à l'intensité du signal) est évaluée sur la base des données fantômes, et les résultats d'une régression linéaire sont appliqués aux régions tissulaires pour quantifier la teneur en Na +.

Études d'activation des cellules immunitaires : les chercheurs détermineront si la sensibilité au sel est associée à l'état d'activation des monocytes humains. Des échantillons de sang hépariné (40 ml) sont obtenus et les PBMC sont isolés par gradient de Ficoll. Les monocytes sont isolés des PBMC par marquage magnétique et sélection négative à l'aide du kit d'isolement de monocytes Miltenyi et analysés par cytométrie en flux. Ils identifient les monocytes comme des cellules CD45+/CD14+ et peuvent examiner plus en détail les monocytes intermédiaires (CD14+/CD16+ et non classiques (CD14-/CD16+). Les cellules CD14+/CD16+, qui représentent environ 10 % de la circulation, présentent un intérêt particulier car elles produisent des niveaux accrus de TNFalpha et favorisent l'activation des lymphocytes T. Celles-ci sont augmentées chez les humains souffrant d'hypertension et en réponse à une exposition élevée au Na+ in vitro. Bien que les sous-types de CD soient relativement rares en nombre, les chercheurs les quantifieront en mesurant les cellules CD45+/CD1c+, CD45+/CD141+, CD45+/CD209+, CD45+/CD83+ et les cellules Axl/SICLEC6 récemment identifiées. Le 7-AAD est utilisé pour exclure les cellules mortes. La coloration intracellulaire avec l'anticorps à chaîne unique D-11 pour détecter les adduits IsoLG-protéine sera utilisée. L'expression de surface de CD80 et CD86, qui sont exprimées sur des cellules matures présentatrices d'antigène leur permettant de participer à la co-stimulation des lymphocytes T, sera mesurée. Caractérisation générale des cellules mononucléaires du sang périphérique par cytométrie en flux pour d'autres cellules inflammatoires, y compris les leucocytes totaux (cellules CD45+), les cellules B (CD45+/CD19+), les cellules T totales (cellules CD45+/CD3+) et le sous-type de cellules T (CD3+/CD8+ et cellules CD4+) seront également réalisées. Ces expériences seront réalisées dans des cellules fraîchement isolées et également dans des monocytes exposés à du sel normal ou à une teneur élevée en sel pendant 48 heures pour déterminer si la sensibilité au sel se reflète dans les monocytes, comme illustré à la Fig. 2. Le milieu de monocytes cultivés pendant 48 heures est analysé pour la libération de cytokines, y compris IL-1 bêta, TNF-alpha, IL-6 et IL-23 à l'aide de luminex. Les chercheurs obtiendront également du plasma pour évaluer les cytokines, notamment le GM-CSF, l'IL-4 et le ligand Flt3, responsables de la conversion des monocytes en DC. Pour assurer la reproductibilité, les échantillons seront soumis à la Vanderbilt Endocrinology and Metabolism Core Facility pour effectuer une analyse Luminex en aveugle. Les mesures de la production d'O2·- et de l'activation de la NADPH oxydase, y compris la phosphorylation de p47phox et l'association de p47phox avec gp91phox par immunoprécipitation et western blot à la fois au départ et en réponse à une élévation de Na+ seront effectuées précédemment décrites.