Wrażliwość na sól i aktywacja komórek odpornościowych

Badacze zastosują protokół Weinbergera u 20 pacjentów, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami. Doradzą uczestnikom, aby utrzymali swoją zwykłą dietę i spożycie soli do rozpoczęcia protokołu oraz przekażą im pojemnik i odpowiednią instrukcję pobrania dobowej próbki moczu na dzień przed przyjęciem do szpitala. Przyjęcie nastąpi dwa tygodnie później, w celu wypłukania działania leków, a wieczorem, aby pacjent mógł odpocząć przez noc w szpitalu przed przystąpieniem do protokołu. W ciągu tych dwóch tygodni nieleczone ciśnienie krwi będzie monitorowane przez pacjentów w domu lub podczas zaplanowanych wizyt przejściowych, aby upewnić się, że nie przekracza 180/110 mmHg, w którym to przypadku protokół zostanie przerwany ze względów bezpieczeństwa. Przy przyjęciu zostanie zmierzona objętość wyjściowego moczu, a porcje zostaną przesłane do laboratorium lub zamrożone w temperaturze -80°C w celu uzyskania analitów badawczych. Rano po przyjęciu (6 rano) zostanie ustawiony ambulatoryjny ciśnieniomierz (SpaceLabs 90207 lub 90210) do ciągłego rejestrowania ciśnienia krwi podczas całego badania (co 15 minut od 6:00 do 22:00 i co 30 minut od 22:00 do 6 rano), zostanie zarejestrowana masa ciała pacjenta w fartuchu (taka sama skala jak w kolejnych dniach), pobrane zostaną próbki krwi dla analitów badania opisanego poniżej (badania bazowe), oraz zostanie pobrana nowa 24-godzinna zbiórka rozpoczęty na okres załadunku soli o godzinie 8 rano. Obciążenie solą zostanie osiągnięte poprzez połączenie diety wysokosolnej (izokalorycznej, zawierającej 160 mEq Na i 70 mEq K), którą pacjent zużyje w całości, oraz wlew 2 l soli fizjologicznej (300 mEq Na+). Pacjenci będą mieli swobodny dostęp do wody, ale ich wyżywienie będzie ograniczone do tego przewidzianego protokołem. Pójdą spać o 22:00. Następnego ranka (6 rano) ponownie zostaną pobrane próbki masy ciała i krwi, a 24-godzinne pobieranie zostanie zakończone zamierzonym oddaniem moczu o godzinie 8 rano. Te dane laboratoryjne będą odzwierciedlać wpływ obciążenia solą. O godzinie 8:00 badani zostaną poddani odwodnieniu. Osiąga się to poprzez podawanie diety izokalorycznej zawierającej 10 mEq Na i 70 mEq K oraz ciągłe nieograniczone spożycie wody. O godzinie 8:00, 12:00 i 16:00 badanym zostanie podane doustnie 40 mg furosemidu. Dodatkowa 12-godzinna zbiórka moczu zostanie rozpoczęta o godzinie 8:00 i zakończona celowym oddaniem moczu o godzinie 20:00 (odzwierciedlając okres furosemidu natriurezy). Nowa 12-godzinna zbiórka rozpocznie się o godzinie 20:00 i zakończy się celowym wypróżnieniem następnego ranka o godzinie 8:00 (odzwierciedlając okres wyczerpywania się soli). Następnego ranka (6.00) nastąpi ostatni pomiar masy ciała i pobranie krwi, a do godz. 8.00 zakończy się 12-godzinna zbiórka moczu na okres niedoboru soli. Pacjenci otrzymają śniadanie z normalnej diety szpitalnej, które może być uzupełnione słonymi pokarmami lub płynami, jeśli interwencja z niedoborem soli wywoła zawroty głowy lub udokumentowaną ortostazę. Gdy pacjent jest stabilny i wykazuje tolerancję na postawę pionową, zostanie wypisany do domu z zaleceniem wznowienia leczenia hipotensyjnego, chyba że obecność ortostazy wymaga modyfikacji schematu, co zostanie zalecone przez lekarza członka zespołu badawczego zespół.

Laboratoryjne pomiary krwi: Badania, które należy przeprowadzić w ramach 3 codziennych zestawów próbek krwi będą obejmowały; CBC i rutynowe badania chemiczne (w tym kreatynina w surowicy, Na+ i K+) w centralnym laboratorium VUMC; Aktywność reniny osocza metodą radioimmunologiczną; Aldosteron w osoczu metodą radioimmunologiczną; Osoczowe kwasy eikozatrienowe (EET) i kwas 20-hydroksyeikozatetraenowy (20-HETE) w eikozanoidowym rdzeniu VUMC metodą chromatografii cieczowej/tandemowej spektrometrii mas.

Analiza moczu: Badania, które należy przeprowadzić w 4 próbkach moczu (24-godzinna linia podstawowa, 24-godzinne nasycenie solą, 12-godzinna natriureza z furosemidem i 12-godzinna utrata soli) będą obejmować; Stężenia Na+, K+ i kreatyniny w laboratorium centralnym VUMC; Kwasy eikozatrienowe w moczu (EET) i kwas 20-hydroksyeikozatetraenowy (20-HETE) w rdzeniu eikozanoidowym VUMC metodą chromatografii cieczowej/tandemowej spektrometrii mas.

Definicja wrażliwości na sól w ciśnieniu krwi: Dane ciśnienia krwi z monitorów zostaną pobrane, a średnia skurczowego ciśnienia krwi z dnia obciążenia solą, od godziny 12:00 (koniec wlewu soli fizjologicznej) do godziny 22:00 zostanie wykorzystana jako BP dla okresu nauki z obciążeniem solą. Średnie ciśnienie skurczowe krwi w dniu niedoboru soli, od godz. 12.00 (druga dawka furosemidu) do godz. Spadek skurczowego BP ≥ 10 mm Hg od okresu obciążenia solą do okresu niedoboru soli zostanie wykorzystany do zaklasyfikowania pacjenta jako wrażliwego na sól.

Obrazowanie MRI sodu: Badacze nieinwazyjnie wykryją magazynowanie Na+ w tkankach ludzkich w instytucie obrazowania Vanderbilt. Określą ilościowo zawartość Na+ w skórze za pomocą 23Na MRI, ściśle przestrzegając wcześniej zgłoszonych podejść.6, 37, 38. Obrazowanie wykonuje się na skanerze Philips Achieva 3.0T MR (Philips Healthcare, Cleveland OH, USA) z kwadraturową cewką kolanową 23Na (Rapid Biomedical GmbH, Rimpar, Niemcy). Badacze używają fantomów kalibracyjnych (wodnych roztworów o rosnącym stężeniu NaCl) jako wzorców odniesienia i skanują je razem z przekrojami mięśni łydek badanego w celu kontroli jakości. Lewa dolna część nogi (najszersza część okolicy łydki) jest skanowana ze skórą ściśle stykającą się z twardą powierzchnią uchwytu fantomu przez 3 minuty i 52 sekundy. Wszystkie dane obrazowania są przetwarzane off-line za pomocą niestandardowych skryptów MATLAB (R2013a). Kwantyfikacja Na+ jest wykonywana przez porównanie intensywności sygnału pomiędzy tkanką i fantomami kalibracyjnymi na obrazie Na+. Na podstawie danych fantomowych ocenia się zależność liniową (stężenie Na+ względem intensywności sygnału), a wyniki regresji liniowej stosuje się do obszarów tkanki w celu ilościowego określenia zawartości Na+.

Badania aktywacji komórek odpornościowych: Badacze ustalą, czy wrażliwość na sól jest związana ze stanem aktywacji ludzkich monocytów. Otrzymuje się heparynizowane próbki krwi (40 ml) i PBMC izoluje się za pomocą gradientu Ficolla. Monocyty są izolowane z PBMC przez znakowanie magnetyczne i selekcję negatywną przy użyciu zestawu do izolacji monocytów Miltenyi i analizowane przy użyciu cytometrii przepływowej. Identyfikują monocyty jako komórki CD45+/CD14+ i mogą dalej badać pośrednie (CD14+/CD16+ i nieklasyczne monocyty (CD14-/CD16+). Komórki CD14+/CD16+, które stanowią około 10% krążenia, są szczególnie interesujące, ponieważ wytwarzają zwiększone poziomy TNFalfa i promują aktywację komórek T. Są one zwiększone u ludzi z nadciśnieniem iw odpowiedzi na podwyższoną ekspozycję na Na+ in vitro. Chociaż podtypy DC są stosunkowo rzadkie, badacze określą je ilościowo, mierząc komórki CD45+/CD1c+, CD45+/CD141+, CD45+/CD209+, CD45+/CD83+ i niedawno zidentyfikowane komórki Axl/SICLEC6. 7-AAD służy do wykluczenia martwych komórek. Zastosowane zostanie wewnątrzkomórkowe barwienie jednołańcuchowym przeciwciałem D-11 w celu wykrycia adduktów IsoLG-białko. Zmierzona zostanie ekspresja powierzchniowa CD80 i CD86, które ulegają ekspresji na dojrzałych komórkach prezentujących antygen, umożliwiając im udział w kostymulacji limfocytów T. Ogólna charakterystyka jednojądrzastych komórek krwi obwodowej metodą cytometrii przepływowej pod kątem innych komórek zapalnych, w tym leukocytów ogółem (komórki CD45+), limfocytów B (CD45+/CD19+), limfocytów T ogółem (komórki CD45+/CD3+) oraz podtypu limfocytów T (CD3+/CD8+ i Komórki CD4+) również zostaną wykonane. Eksperymenty te zostaną przeprowadzone na świeżo wyizolowanych komórkach, a także na monocytach wystawionych na działanie normalnej lub wysokiej soli przez 48 godzin w celu określenia, czy monocyty wykazują wrażliwość na sól, jak pokazano na ryc. 2. Pożywka z monocytów hodowanych przez 48 godzin jest analizowano pod kątem uwalniania cytokin, w tym IL-1 beta, TNF-alfa, IL-6 i IL-23 przy użyciu lumineksu. Badacze uzyskają również osocze w celu oceny cytokin, w tym GM-CSF, IL-4 i ligandu Flt3, które są odpowiedzialne za konwersję monocytów do DC. Aby zapewnić powtarzalność, próbki zostaną przesłane do Vanderbilt Endocrinology and Metabolism Core Facility w celu przeprowadzenia ślepej analizy Luminex. Pomiary produkcji O2·- i aktywacji oksydazy NADPH, w tym fosforylacji p47phox i asocjacji p47phox z gp91phox przez immunoprecypitację i western blot, zarówno na linii podstawowej, jak iw odpowiedzi z podwyższonym poziomem Na+, zostaną wykonane wcześniej, jak opisano.