Saltkänslighet och immunitetscellaktivering

Utredarna kommer att använda Weinberger-protokollet på 20 patienter som tidigare rapporterats. De kommer att råda deltagarna att bibehålla sin vanliga diet och saltkonsumtion tills protokollet börjar och förse dem med en behållare och lämpliga instruktioner för att ta ett 24-timmars urinprov dagen före inläggning på sjukhuset. Intagning kommer att ske två veckor senare, för att tvätta ut effekten av medicinerna, och på en kväll för att patienten ska vila över natten på sjukhuset innan protokollet börjar. Under dessa två veckor kommer obehandlat blodtryck att övervakas antingen av patienterna hemma eller vid interimistiska schemalagda besök, för att säkerställa att det inte överstiger 180/110 mmHg, i vilket fall protokollet kommer att avbrytas för säkerhets skull. Vid intagning kommer volymen av baslinjeurinen att mätas och alikvoter skickas till labbet eller frysas vid -800°C för forskningsanalyter. På morgonen efter inläggningen (6 på morgonen) kommer en ambulerande blodtrycksmätare (SpaceLabs 90207 eller 90210) att ställas in för kontinuerlig blodtrycksmätning under hela studien (var 15:e minut från 06:00 till 22:00 och var 30:e minut från 22:00 till 06.00), kommer kroppsvikten att registreras när patienten bär en klänning (samma våg som kommande dagar), blodprov kommer att tas för analyterna från studien som beskrivs nedan (baslinjetest), och en ny 24-timmarssamling kommer att göras. började för perioden med saltladdning klockan 8.00. Saltladdning kommer att uppnås genom kombinationen av en diet med hög salthalt (isokalorisk, med 160 mEq Na och 70 mEq K), som patienten kommer att konsumera i sin helhet, och en infusion av 2L saltlösning (300 mEq Na+). Patienterna kommer att ha fri tillgång till vatten men deras mat kommer att vara begränsad till den som tillhandahålls av protokollet. De går och lägger sig vid 22-tiden. Följande morgon (06.00) kommer kroppsvikt och blodprover återigen att tas, och 24-timmarsinsamlingen kommer att slutföras med en avsiktlig tömning klockan 8.00. Dessa laboratoriedata kommer att återspegla effekten av saltladdning. Klockan 8 kommer försökspersoner att utsättas för saltutarmning. Detta åstadkoms genom att administrera en isokaloridiet innehållande 10 mEq Na och 70 mEq K och fortsatt obegränsat vattenintag. Klockan 08.00, 12.00 och 16.00 kommer försökspersonerna att ges 40 mg furosemid oralt. En ytterligare 12-timmars urininsamling kommer att påbörjas kl. 08.00 och avslutas med ett avsiktligt tomrum kl. 20.00 (som återspeglar perioden med furosemidnatriures). En ny 12-timmars insamling kommer att börja kl. 20.00, för att stängas med avsiktlig tömning nästa morgon kl. 8.00 (som återspeglar perioden med saltutarmning). Nästa morgon (kl. 06.00) kommer den sista registreringen av kroppsvikt och blodprovstagning att ske, och senast kl. 08.00 kommer 12-timmarsurinsamlingen för perioden med saltutarmning att vara klar. Patienterna kommer att få frukost från en vanlig sjukhuskost, som kan kompletteras med salt mat eller vätska om saltutarmningsingreppet orsakade yrsel eller dokumenterad ortostas. När patienten är stabil och uppvisar tolerans mot den upprättstående ställningen, kommer han/hon att skrivas ut hem med instruktioner om att återuppta antihypertensiva mediciner, såvida inte närvaron av ortostas kräver en modifiering av regimen, vilket kommer att rekommenderas av en läkare som är medlem i forskningen. team.

Laboratorieblodmätningar: Tester som ska utföras i de 3 dagliga uppsättningarna av blodprover kommer att inkludera; CBC och rutinkemi (inklusive serumkreatinin, Na+ och K+) vid VUMC:s centrala laboratorium; Plasmareninaktivitet genom radioimmunoanalys; Plasmaaldosteron genom radioimmunoanalys; Plasmaeikosatriensyror (EET) och 20-hydroxieikosatetraensyra (20-HETE) vid eikosanoidkärnan i VUMC genom vätskekromatografi/tandemmasspektrometri.

Urinanalys: Tester som ska utföras i de 4 urinproverna (24 timmars baslinje, 24 timmars saltladdning, 12 timmars furosemidnatriures och 12 timmars saltutarmning) kommer att inkludera; Na+, K+ och kreatininkoncentration vid VUMC:s centrala laboratorium; Eikosatriensyror i urin (EET) och 20-hydroxieikosatetraensyra (20-HETE) vid eikosanoidkärnan i VUMC genom vätskekromatografi/tandemmasspektrometri.

Definition av blodtryckets saltkänslighet: Blodtrycksdata från monitorerna kommer att laddas ner och genomsnittet av det systoliska blodtrycket för dagen för saltladdning, från kl. 12.00 (slutet av saltlösningsinfusionen) till kl. 22.00 kommer att användas som BP för studieperioden för saltladdning. Genomsnittet av det systoliska blodtrycket för dagen för saltutarmningen, från kl. 12.00 (andra dosen av furosemid) till kl. 22.00 kommer att användas som BP för den saltfattiga studieperioden. Ett fall i systoliskt BP ≥10 mm Hg från saltladdningsperioden till saltutarmningsperioden kommer att användas för att klassificera en patient som saltkänslig.

Natrium-MR-avbildning: Utredarna kommer icke-invasivt att upptäcka Na+-lagring i vävnader hos människor vid Vanderbilts avbildningsinstitut. De kommer att kvantifiera Na+-innehållet i huden med 23Na MRI med strikt efterlevnad av tidigare rapporterade metoder.6, 37, 38. Avbildning görs på en Philips Achieva 3.0T MR-skanner (Philips Healthcare, Cleveland OH, USA) med en 23Na kvadratur knäspole (Rapid Biomedical GmbH, Rimpar, Tyskland). Utredarna använder kalibreringsfantomer (vattenlösningar med ökande NaCl-koncentrationer) som referensstandarder och skannar dem tillsammans med snitt genom försökspersonens vadmuskler för kvalitetskontroll. Det vänstra underbenet (den bredaste delen av vadområdet) skannas med huden nära i kontakt med den hårda ytan på fantomhållaren i 3 minuter och 52 sekunder. All bilddata bearbetas offline med anpassade MATLAB (R2013a) skript. Na+-kvantifiering utförs genom att jämföra signalintensiteter mellan vävnad och kalibreringsfantomer på Na+-bilden. Ett linjärt samband (Na+-koncentration vs signalintensitet) bedöms baserat på fantomdata, och resultat från en linjär regression appliceras på vävnadsregioner för att kvantifiera Na+-innehållet.

Immuncellsaktiveringsstudier: Utredarna kommer att avgöra om saltkänslighet är associerad med aktiveringstillståndet hos mänskliga monocyter. Hepariniserade blodprov (40 ml) erhålls och PBMCs isoleras med Ficoll-gradient. Monocyter isoleras från PBMC genom magnetisk märkning och negativt urval med hjälp av Miltenyi monocytisoleringskit och analyseras med flödescytometri. De identifierar monocyter som CD45+/CD14+-celler och kan ytterligare undersöka mellanliggande (CD14+/CD16+ och icke-klassiska monocyter (CD14-/CD16+). CD14+/CD16+-cellerna som utgör cirka 10 % av cirkulationen, är av särskilt intresse, de producerar ökade nivåer av TNFalfa och främjar T-cellsaktivering. Dessa ökar hos människor med hypertoni och som svar på in vitro förhöjd Na+-exponering. Även om undertyper av DC är relativt sällsynta i antal kommer utredarna att kvantifiera dem genom att mäta CD45+/CD1c+, CD45+/CD141+, CD45+/CD209+, CD45+/CD83+ och de nyligen identifierade Axl/SICLEC6-cellerna. 7-AAD används för att utesluta döda celler. Intracellulär färgning med den enkelkedjiga antikroppen D-11 för att detektera IsoLG-proteinaddukter kommer att användas. Ytuttryck av CD80 och CD86, som uttrycks på mogna antigenpresenterande celler som tillåter dem att delta i T-cellssamstimulering kommer att mätas. Allmän karakterisering av perifera mononukleära blodceller genom flödescytometri för andra inflammatoriska celler inklusive totala leukocyter (CD45+-celler), B-celler (CD45+/CD19+), totala T-celler (CD45+/CD3+-celler) och T-cellssubtypen (CD3+/CD8+ och CD4+)-celler kommer också att utföras. Dessa experiment kommer att utföras i nyligen isolerade celler och även i monocyter som exponerats för normalt salt eller hög salthalt i 48 timmar för att fastställa om saltkänslighet återspeglas i monocyterna som visas i fig. 2. Medium från monocyter odlade under 48 timmar är analyserades för cytokinfrisättning inklusive IL-1 beta, TNF-alfa, IL-6 och IL-23 med användning av luminex. Utredarna kommer också att få plasma för att bedöma för cytokiner inklusive GM-CSF, IL-4 och Flt3 ligand som är ansvariga för omvandling av monocyter till DC. För att säkerställa reproducerbarhet kommer proverna att skickas till Vanderbilt Endocrinology and Metabolism Core Facility för att utföra en blindad Luminex-analys. Mätningar av O2·-produktion och aktivering av NADPH-oxidas inklusive fosforylering av p47phox och association av p47phox med gp91phox genom immunoutfällning och western blöt både vid baslinjen och som svar förhöjt Na+ kommer att göras tidigare beskrivna.