Activación de células de inmunidad y sensibilidad a la sal

Los investigadores emplearán el protocolo de Weinberger en 20 pacientes como se informó anteriormente. Aconsejarán a los participantes que mantengan su dieta habitual y el consumo de sal hasta el inicio del protocolo y les proporcionarán un recipiente e instrucciones adecuadas para recoger una muestra de orina de 24 horas el día anterior al ingreso en el hospital. El ingreso se realizará dos semanas más tarde, para el lavado del efecto de los medicamentos, y por la noche, para que el paciente descanse durante la noche en el hospital antes del inicio del protocolo. Durante estas dos semanas, la presión arterial no tratada será monitoreada por los pacientes en su domicilio o en visitas programadas intermedias, para asegurar que no supere los 180/110 mmHg, en cuyo caso se suspenderá el protocolo por seguridad. En el momento de la admisión, se medirá el volumen de la orina inicial y se enviarán alícuotas al laboratorio o se congelarán a -800 °C para analitos de investigación. En la mañana posterior a la admisión (6 a. m.), se configurará un monitor de presión arterial ambulatorio (SpaceLabs 90207 o 90210) para registrar la presión arterial de manera continua durante todo el estudio (cada 15 minutos desde las 6 a. m. hasta las 10 p. m. y cada 30 minutos desde las 10 p. m. 6 a.m.), se registrará el peso corporal con el paciente en bata (misma báscula que los próximos días), se tomarán muestras de sangre para los analitos del estudio que se describen a continuación (pruebas basales), y se realizará una nueva recolección de 24 horas. comenzó para el período de carga de sal a las 8 am. La carga de sal se conseguirá mediante la combinación de una dieta rica en sal (isocalórica, con 160 mEq Na y 70 mEq K), que el paciente consumirá en su totalidad, y una infusión de 2L de solución salina (300 mEq Na+). Los pacientes tendrán libre acceso al agua pero su alimentación se limitará a la prevista por el protocolo. Se retirarán a la cama a las 10 de la noche. A la mañana siguiente (6 a. m.) se volverán a tomar muestras de sangre y peso corporal, y la recolección de 24 horas se completará con una micción intencional a las 8 a. m. Estos datos de laboratorio reflejarán el efecto de la carga de sal. A las 8 am, los sujetos serán sometidos a depleción de sal. Esto se logra mediante la administración de una dieta isocalórica que contenga 10 mEq de Na y 70 mEq de K y una ingestión continua e ilimitada de agua. A las 8 am, 12 pm y 4 pm, los sujetos recibirán 40 mg de furosemida por vía oral. Se iniciará una recolección de orina adicional de 12 horas a las 8 a. m. y se terminará con una micción intencional a las 8 p. m. (que refleja el período de natriuresis por furosemida). Una nueva recolección de 12 horas comenzará a las 8 p. m. y se cerrará con la micción intencional a la mañana siguiente a las 8 a. m. (reflejando el período de agotamiento de la sal). A la mañana siguiente (6 am) se llevará a cabo el último registro del peso corporal y extracción de muestras de sangre, ya las 8 am se completará la recolección de orina de 12 horas para el período de agotamiento de sal. Los pacientes recibirán el desayuno de la dieta habitual del hospital, que podrá complementarse con alimentos salados o líquidos si la intervención de depleción de sal produjo mareos u ortostasis documentada. Una vez que el paciente se encuentre estable y presente tolerancia a la postura erguida, será dado de alta a su domicilio con indicación de reanudar la medicación antihipertensiva, salvo que la presencia de ortostasis requiera una modificación en la pauta, que será aconsejada por un médico integrante de la investigación. equipo.

Mediciones de sangre de laboratorio: Las pruebas que se realizarán en los 3 conjuntos diarios de muestras de sangre incluirán; CBC y químicas de rutina (incluyendo creatinina sérica, Na+ y K+) en el laboratorio central de VUMC; actividad de renina plasmática por radioinmunoensayo; aldosterona plasmática por radioinmunoensayo; Ácidos eicosatrienoicos plasmáticos (EET) y ácido 20-hidroxieicosatetraenoico (20-HETE) en el núcleo eicosanoide de VUMC mediante cromatografía líquida/espectrometría de masas en tándem.

Análisis de orina: Las pruebas que se realizarán en las 4 muestras de orina (línea de base de 24 horas, carga de sal de 24 horas, natriuresis de furosemida de 12 horas y depleción de sal de 12 horas) incluirán; concentración de Na+, K+ y creatinina en el laboratorio central de VUMC; Ácidos eicosatrienoicos en orina (EET) y ácido 20-hidroxieicosatetraenoico (20-HETE) en el núcleo eicosanoide de VUMC por cromatografía líquida/espectrometría de masas en tándem.

Definición de la sensibilidad a la sal de la presión arterial: Se descargarán los datos de presión arterial de los monitores y se utilizará como base el promedio de la presión arterial sistólica del día de la carga de sal, desde las 12 del mediodía (fin de la infusión de solución salina) hasta las 10 de la noche. BP para el período de estudio de carga de sal. El promedio de la presión arterial sistólica del día de la depleción de sal, desde las 12 del mediodía (segunda dosis de furosemida) hasta las 10 de la noche, se utilizará como PA para el período de estudio de depleción de sal. Una caída en la PA sistólica ≥10 mm Hg desde los períodos de carga de sal hasta los períodos de depleción de sal se utilizará para clasificar a un sujeto como sensible a la sal.

Resonancia magnética con sodio: los investigadores detectarán de manera no invasiva el almacenamiento de Na+ en tejidos humanos en el instituto de imágenes de Vanderbilt. Cuantificarán el contenido de Na+ en la piel mediante resonancia magnética 23Na con un cumplimiento riguroso de los enfoques informados previamente.6, 37, 38. La imagen se realiza en un escáner de resonancia magnética Philips Achieva 3.0T (Philips Healthcare, Cleveland OH, EE. UU.) con una bobina de rodilla en cuadratura 23Na (Rapid Biomedical GmbH, Rimpar, Alemania). Los investigadores utilizan fantomas de calibración (soluciones acuosas con concentraciones crecientes de NaCl) como estándares de referencia y los escanean junto con secciones a través de los músculos de la pantorrilla del sujeto para el control de calidad. La parte inferior de la pierna izquierda (la parte más ancha de la región de la pantorrilla) se escanea con la piel en estrecho contacto con la superficie dura del soporte del fantasma durante 3 minutos y 52 segundos. Todos los datos de imágenes se procesan fuera de línea con scripts personalizados de MATLAB (R2013a). La cuantificación de Na+ se realiza comparando las intensidades de señal entre el tejido y los fantasmas de calibración en la imagen de Na+. Se evalúa una relación lineal (concentración de Na+ frente a intensidad de la señal) en función de los datos fantasma y los resultados de una regresión lineal se aplican a las regiones de tejido para cuantificar el contenido de Na+.

Estudios de activación de células inmunitarias: los investigadores determinarán si la sensibilidad a la sal está asociada con el estado de activación de los monocitos humanos. Se obtienen muestras de sangre heparinizada (40 ml) y se aíslan las PBMC mediante gradiente de Ficoll. Los monocitos se aíslan de las PBMC mediante marcado magnético y selección negativa utilizando el kit de aislamiento de monocitos Miltenyi y se analizan mediante citometría de flujo. Identifican los monocitos como células CD45+/CD14+ y pueden examinar más a fondo los monocitos intermedios (CD14+/CD16+ y no clásicos (CD14-/CD16+). Las células CD14+/CD16+, que comprenden aproximadamente el 10 % de la circulación, son de particular interés porque producen niveles elevados de TNFalfa y promueven la activación de las células T. Estos aumentan en humanos con hipertensión y en respuesta a una exposición elevada de Na+ in vitro. Aunque los subtipos de CD son relativamente raros en número, los investigadores los cuantificarán midiendo CD45+/CD1c+, CD45+/CD141+, CD45+/CD209+, CD45+/CD83+ y las células Axl/SICLEC6 recientemente identificadas. 7-AAD se utiliza para excluir las células muertas. Se utilizará la tinción intracelular con el anticuerpo monocatenario D-11 para detectar aductos de proteína IsoLG. Se medirá la expresión superficial de CD80 y CD86, que se expresan en células presentadoras de antígeno maduras que les permiten participar en la coestimulación de células T. Caracterización general de las células mononucleares de sangre periférica mediante citometría de flujo para otras células inflamatorias, incluidos los leucocitos totales (células CD45+), las células B (CD45+/CD19+), las células T totales (células CD45+/CD3+) y el subtipo de células T (CD3+/CD8+ y También se realizarán análisis de células CD4+). Estos experimentos se realizarán en células recién aisladas y también en monocitos expuestos a sal normal o alta en sal durante 48 horas para determinar si la sensibilidad a la sal se refleja en los monocitos como se muestra en la Fig. 2. El medio de monocitos cultivados durante 48 horas es se analizó la liberación de citocinas, incluidas IL-1 beta, TNF-alfa, IL-6 e IL-23 usando luminex. Los investigadores también obtendrán plasma para evaluar las citocinas, incluidos GM-CSF, IL-4 y el ligando Flt3, que son responsables de la conversión de monocitos en DC. Para garantizar la reproducibilidad, las muestras se enviarán al Centro básico de endocrinología y metabolismo de Vanderbilt para realizar un análisis Luminex ciego. Las mediciones de la producción de O2·- y la activación de la NADPH oxidasa, incluida la fosforilación de p47phox y la asociación de p47phox con gp91phox mediante inmunoprecipitación y transferencia Western, tanto al inicio como en respuesta al Na+ elevado, se realizarán descritas anteriormente.