Suolaherkkyys ja immuniteettisolujen aktivointi

Kuten aiemmin on raportoitu, tutkijat käyttävät Weinberger-protokollaa 20 potilaaseen. He neuvovat osallistujia säilyttämään tavanomaisen ruokavalionsa ja suolankulutuksensa protokollan alkamiseen asti ja antavat heille astian ja asianmukaiset ohjeet 24 tunnin virtsanäytteen keräämiseksi päivää ennen sairaalaan saapumista. Vastaanotto tapahtuu kahden viikon kuluttua lääkkeiden vaikutuksen huuhtoutumiseksi ja iltana, jolloin potilas lepää yön yli sairaalassa ennen protokollan alkamista. Näiden kahden viikon aikana potilaat tarkkailevat hoitamatonta verenpainetta joko kotona tai väliaikakäynneillä varmistaakseen, että se ei ylitä arvoa 180/110 mmHg, jolloin protokolla lopetetaan turvallisuussyistä. Sisäänpääsyn yhteydessä mitataan lähtötilan virtsan tilavuus ja alikvootit lähetetään laboratorioon tai pakastetaan -800 C:een tutkimusanalyyttejä varten. Pääsyn jälkeisenä aamuna (6.00) asetetaan ambulatorinen verenpainemittari (SpaceLabs 90207 tai 90210) jatkuvaa verenpaineen mittausta varten koko tutkimuksen ajan (15 minuutin välein klo 6-22 ja 30 minuutin välein klo 22-22). kello 6.00), paino kirjataan potilaan pukeutuneena takkiin (samassa mittakaavassa kuin tulevina päivinä), verinäytteitä otetaan alla kuvatun tutkimuksen analyyteille (perustestit) ja uusi 24 tunnin keräys. alkoi suolalatausjaksolle klo 8. Suolalataus saavutetaan yhdistämällä runsaasti suolaa sisältävä ruokavalio (isokalorinen, 160 mEq Na ja 70 mEq K), jonka potilas kuluttaa kokonaisuudessaan, ja 2 litran suolaliuosta (300 mEq Na+) sisältävä infuusio. Potilaat saavat vapaasti vettä, mutta heidän ruokansa rajoitetaan protokollan tarjoamaan määrään. He jäävät nukkumaan klo 22. Seuraavana aamuna (6.00) otetaan jälleen ruumiinpaino- ja verinäytteet, ja 24 tunnin keräys päätetään tarkoituksellisella tyhjennyksellä klo 8. Nämä laboratoriotiedot heijastavat suolakuormituksen vaikutusta. Klo 8.00 koehenkilöt altistetaan suolanpoistolle. Tämä saavutetaan antamalla isokalorista ruokavaliota, joka sisältää 10 mekvivalenttia Na:a ja 70 mekvivalenttia K, ja jatkuvalla rajoittamattomalla vedenkulutuksella. Klo 8.00, 12.00 ja 16.00 koehenkilöille annetaan 40 mg furosemidia suun kautta. Ylimääräinen 12 tunnin virtsankeruu aloitetaan klo 8.00 ja päättyy tahalliseen tyhjiöön klo 20.00 (heijastaa furosemidin natriureesin ajanjaksoa). Uusi 12 tunnin keräys alkaa klo 20, ja se suljetaan tarkoituksellisella tyhjennyksellä seuraavana aamuna klo 8.00 (heijastaen suolan loppumisen aikaa). Seuraavana aamuna (6.00) suoritetaan viimeinen painomittaus ja verinäytteiden otto ja klo 8.00 mennessä suolapoistoajan 12 tunnin virtsankeruu valmistuu. Potilaat saavat aamupalan tavanomaisesta sairaalaruokavaliosta, jota voidaan täydentää suolaisella ruoalla tai nesteellä, jos suolanpoistotoimenpide aiheutti huimausta tai dokumentoitua ortostaasia. Kun potilas on vakaa ja sietää pystyasennon, hänet kotiutetaan kotiin ohjeilla jatkaa verenpainelääkitystä, ellei ortostaasin esiintyminen edellytä hoito-ohjelman muuttamista, minkä neuvoo tutkimukseen osallistuva lääkäri. tiimi.

Laboratorioverimittaukset: Kolmessa päivittäisessä verinäytteessä suoritettavat testit sisältävät; CBC:t ja rutiinikemiat (mukaan lukien seerumin kreatiniini, Na+ ja K+) VUMC:n keskuslaboratoriossa; Plasman reniiniaktiivisuus radioimmunomäärityksellä; Plasman aldosteroni radioimmunomäärityksellä; Plasman eikosatrieenihapot (EET) ja 20-hydroksieikosatetraeenihappo (20-HETE) VUMC:n eikosanoidiytimessä nestekromatografialla/tandemmassaspektrometrialla.

Virtsaanalyysi: Testit, jotka suoritetaan neljällä virtsanäytteellä (24 tunnin lähtötaso, 24 tunnin suolan lisäys, 12 tunnin furosemidin natriureesi ja 12 tunnin suolanpoisto) sisältävät; Na+-, K+- ja kreatiniinipitoisuus VUMC:n keskuslaboratoriossa; Virtsan eikosatrieenihapot (EET) ja 20-hydroksieikosatetraeenihappo (20-HETE) VUMC:n eikosanoidiytimessä nestekromatografialla/tandemmassaspektrometrialla.

Verenpaineen suolaherkkyyden määritelmä: Monitorien verenpainetiedot ladataan ja suolalatauspäivän systolisen verenpaineen keskiarvoa kello 12 (suolaliuoksen infuusion päättymisestä) klo 22.00 välisenä aikana käytetään. BP tutkimuksen suolalatausjakson aikana. Suolapuutteen päivän verenpaineen keskiarvoa kello 12.00 (toinen furosemidiannos) klo 22.00 välisenä aikana käytetään verenpaineena suolavajausjaksolle. Systolisen verenpaineen laskua ≥ 10 mm Hg suolalatauksesta suolavajauksen jaksoihin käytetään kohteen luokittelemiseksi suolaherkäksi.

Natrium-MRI-kuvaus: Tutkijat havaitsevat ei-invasiivisesti Na+:n varastoinnin ihmisten kudoksissa Vanderbiltin kuvantamislaitoksessa. He määrittävät ihon Na+-pitoisuuden 23Na MRI:llä noudattaen tarkasti aiemmin raportoituja lähestymistapoja.6, 37, 38. Kuvaus tehdään Philips Achieva 3.0T MR-skannerilla (Philips Healthcare, Cleveland OH, USA), jossa on 23Na-kvadratuuripolvikela (Rapid Biomedical GmbH, Rimpar, Saksa). Tutkijat käyttävät kalibrointifantomeja (vesiliuoksia, joiden NaCl-pitoisuudet kasvavat) vertailustandardeina ja skannaavat ne yhdessä pohkeiden pohkeen lihaksien läpi laadunvalvontaa varten. Vasen alareuna (pohkeen alueen levein osa) skannataan ihon ollessa tiiviisti kosketuksessa haamupitimen kovaan pintaan 3 minuutin ja 52 sekunnin ajan. Kaikki kuvantamistiedot käsitellään offline-tilassa mukautetuilla MATLAB (R2013a) -skripteillä. Na+-kvantifiointi suoritetaan vertaamalla signaalin intensiteettejä kudosten ja kalibrointifantomien välillä Na+-kuvassa. Lineaarinen suhde (Na+-pitoisuus vs. signaalin intensiteetti) arvioidaan haamutietojen perusteella, ja lineaarisen regression tuloksia sovelletaan kudosalueisiin Na+-pitoisuuden kvantifioimiseksi.

Immuunisoluaktivaatiotutkimukset: Tutkijat määrittävät, liittyykö suolaherkkyys ihmisen monosyyttien aktivaatiotilaan. Otetaan heparinisoituja verinäytteitä (40 ml) ja PBMC:t eristetään Ficoll-gradientilla. Monosyytit eristetään PBMC:stä magneettisella leimalla ja negatiivisella valinnalla käyttämällä Miltenyi-monosyyttien eristyspakkausta ja analysoidaan käyttämällä virtaussytometriaa. Ne tunnistavat monosyytit CD45+/CD14+-soluiksi ja voivat edelleen tutkia välituotteita (CD14+/CD16+ ja ei-klassiset monosyytit (CD14-/CD16+). CD14+/CD16+-solut, jotka muodostavat noin 10 % verenkierrosta, ovat erityisen kiinnostavia, ne tuottavat kohonneita TNFalpha-tasoja ja edistävät T-soluaktivaatiota. Nämä lisääntyvät ihmisillä, joilla on korkea verenpaine, ja vasteena in vitro kohonneelle Na+-altistukselle. Vaikka DC:iden alatyypit ovat suhteellisen harvinaisia, tutkijat määrittävät ne mittaamalla CD45+/CD1c+, CD45+/CD141+, CD45+/CD209+, CD45+/CD83+ ja äskettäin tunnistetut Axl/SICLEC6-solut. 7-AAD:tä käytetään kuolleiden solujen sulkemiseen pois. Solunsisäistä värjäystä yksiketjuisella vasta-aineella D-11 käytetään IsoLG-proteiiniadduktien havaitsemiseksi. CD80:n ja CD86:n pintaekspressio, jotka ilmentyvät kypsissä antigeeniä esittelevissä soluissa, jolloin ne voivat osallistua T-solujen yhteisstimulaatioon, mitataan. Perifeerisen veren mononukleaaristen solujen yleinen karakterisointi virtaussytometrialla muille tulehdussoluille, mukaan lukien kokonaisleukosyytit (CD45+-solut), B-solut (CD45+/CD19+), kokonais-T-solut (CD45+/CD3+-solut) ja T-solualatyyppi (CD3+/CD8+ ja CD4+) -solut suoritetaan myös. Nämä kokeet suoritetaan vastaeristetyissä soluissa ja myös monosyyteissä, jotka on altistettu normaalille suolalle tai korkealle suolalle 48 tunnin ajan sen määrittämiseksi, näkyykö suolaherkkyys monosyyteissä, kuten kuvassa 2 on esitetty. Elatusaine monosyyteistä, joita on viljelty 48 tuntia, on analysoitiin sytokiinien vapautumisen suhteen, mukaan lukien IL-1 beeta, TNF-alfa, IL-6 ja IL-23 käyttäen luminexia. Tutkijat hankkivat myös plasmaa sytokiinien, mukaan lukien GM-CSF:n, IL-4:n ja Flt3-ligandin, arvioimiseksi, jotka ovat vastuussa monosyyttien muuntamisesta DC:iksi. Toistettavuuden varmistamiseksi näytteet toimitetaan Vanderbilt Endokrinology and Metabolism Core Facilityön suorittamaan sokkoutettu Luminex-analyysi. O2--tuotannon ja NADPH-oksidaasin aktivaation mittaukset, mukaan lukien p47phoxin fosforylaatio ja p47phoxin assosiointi gp91phoxin kanssa immunosaostuksella ja Western blot -menetelmällä sekä lähtötasolla että vasteena kohonneelle Na+:lle, on kuvattu aiemmin.