염 민감도 및 면역 세포 활성화

연구자들은 이전에 보고된 바와 같이 20명의 환자에게 Weinberger 프로토콜을 사용할 것입니다. 그들은 참가자들에게 프로토콜이 시작될 때까지 평소 식단과 소금 섭취를 유지하도록 조언하고 병원 입원 전날 24시간 소변 표본을 수집하기 위한 용기와 적절한 지침을 제공할 것입니다. 입원은 2주 후 약물 효과의 소실을 위해 이루어지며 저녁에는 환자가 프로토콜이 시작되기 전에 병원에서 밤새 휴식을 취합니다. 이 2주 동안 치료되지 않은 혈압은 환자가 집에서 또는 중간 예정된 방문에서 모니터링하여 180/110mmHg를 초과하지 않도록 하고, 이 경우 안전을 위해 프로토콜을 중단합니다. 입원 시 기본 소변의 부피를 측정하고 분취량을 실험실로 보내거나 연구 분석물을 위해 -800C에서 동결합니다. 입원 후 아침(오전 6시)에 이동 혈압 모니터(SpaceLabs 90207 또는 90210)가 연구 전반에 걸쳐 지속적인 혈압 기록을 위해 설정됩니다(오전 6시부터 오후 10시까지 15분마다, 오후 10시부터 오후 10시까지 30분마다). 오전 6시), 환자가 가운을 입은 상태에서 체중을 기록하고(미래와 동일한 척도), 아래에 설명된 연구 분석물에 대한 혈액 샘플을 채취하고(기준선 테스트), 새로운 24시간 수집을 수행합니다. 오전 8시에 소금 장전 기간 동안 시작되었습니다. 염분 부하는 환자가 전체적으로 섭취하는 고염식(등칼로리, 160mEq Na 및 70mEq K)과 2L의 식염수(300mEq Na+) 주입의 조합으로 달성됩니다. 환자는 물을 자유롭게 이용할 수 있지만 음식은 프로토콜에서 제공하는 것으로 제한됩니다. 그들은 오후 10시에 잠자리에 들 것입니다. 다음날 아침(오전 6시) 체중과 혈액 샘플을 다시 채취하고 오전 8시에 의도적 배뇨로 24시간 수집을 완료합니다. 이러한 실험실 데이터는 염 부하의 영향을 반영합니다. 오전 8시에 피험자는 염분이 고갈됩니다. 이것은 10mEq Na 및 70mEq K를 포함하는 등칼로리 식단을 관리하고 계속해서 물을 무제한 섭취함으로써 달성됩니다. 오전 8시, 정오 12시, 오후 4시에 피험자에게 푸로세마이드 40mg을 경구 투여합니다. 추가 12시간 소변 수집은 오전 8시에 시작하여 오후 8시에 의도적 배뇨로 종료됩니다(푸로세마이드 나트륨 이뇨 기간 반영). 새로운 12시간 수집은 오후 8시에 시작하여 다음 날 오전 8시에 의도적인 배뇨로 마감됩니다(소금 고갈 기간 반영). 다음날 아침(오전 6시) 마지막 체중 기록 및 채혈을 하고, 오전 8시까지 염분 고갈 기간 동안 12시간 소변 수집을 완료한다. 환자는 정규 병원 식사로 아침 식사를 제공받게 되며, 염분 고갈 개입으로 현기증이 발생하거나 기립성이 입증된 경우 짠 음식이나 액체로 보충할 수 있습니다. 환자가 안정되고 직립 자세에 대한 내성을 보이면 기립의 존재로 인해 요법의 수정이 필요한 경우가 아닌 한 항 고혈압제를 재개하라는 지시와 함께 집으로 퇴원합니다. 팀.

실험실 혈액 측정: 매일 3세트의 혈액 샘플로 수행되는 테스트에는 다음이 포함됩니다. VUMC의 중앙 실험실에서 CBC 및 일상적인 화학(혈청 크레아티닌, Na+ 및 K+ 포함); 라디오-면역측정법에 의한 혈장 레닌 활성; 라디오-면역측정법에 의한 혈장 알도스테론; 액체 크로마토그래피/탠덤 질량 분석법에 의한 VUMC의 에이코사노이드 코어에서 혈장 에이코사트리에노산(EET) 및 20-하이드록시에이코사테트라에노산(20-HETE).

소변 검사: 4개의 소변 표본(24시간 기준선, 24시간 염 부하, 12시간 푸로세마이드 나트륨 이뇨 및 12시간 염 고갈)에서 수행할 테스트에는 다음이 포함됩니다. VUMC 중앙 실험실의 Na+, K+ 및 크레아티닌 농도; 액체 크로마토그래피/탠덤 질량 분석법에 의한 VUMC의 에이코사노이드 코어에서 소변 에이코사트리에노산(EET) 및 20-히드록시에이코사테트라에노산(20-HETE).

혈압의 소금 민감도 정의: 모니터의 혈압 데이터를 다운로드하고 정오(식염수 주입 종료) 12시(식염수 주입 종료)부터 오후 10시까지 염 부하일의 평균 수축기 혈압을 기준으로 사용합니다. 연구의 소금 부하 기간 동안 BP. 염분 고갈일 정오(푸로세마이드의 두 번째 용량)부터 오후 10시까지의 평균 수축기 혈압을 염 고갈 연구 기간의 BP로 사용합니다. 소금 부하에서 염 고갈 기간까지 수축기 혈압 ≥10mmHg의 감소는 피험자를 염분 민감성으로 분류하는 데 사용됩니다.

나트륨 MRI 이미징: 조사관은 Vanderbilt 이미징 연구소에서 인간 조직의 Na+ 저장을 비침습적으로 감지합니다. 그들은 이전에 보고된 접근법을 엄격하게 준수하는 23Na MRI로 피부의 Na+ 함량을 정량화할 것입니다.6, 37, 38. 이미징은 23Na 구적 무릎 코일(Rapid Biomedical GmbH, Rimpar, Germany)이 있는 Philips Achieva 3.0T MR 스캐너(Philips Healthcare, Cleveland OH, USA)에서 수행됩니다. 조사관은 참조 표준으로 보정 팬텀(NaCl 농도가 증가하는 수용액)을 사용하고 품질 관리를 위해 피험자의 종아리 근육을 통해 섹션과 함께 스캔합니다. 3분 52초 동안 팬텀 홀더의 딱딱한 표면에 피부가 밀착된 상태에서 왼쪽 다리(종아리 부위의 가장 넓은 부분)를 스캔합니다. 모든 이미징 데이터는 맞춤형 MATLAB(R2013a) 스크립트를 사용하여 오프라인으로 처리됩니다. Na+ 정량화는 Na+ 이미지에서 조직과 보정 팬텀 사이의 신호 강도를 비교하여 수행됩니다. 팬텀 데이터를 기반으로 선형 관계(Na+ 농도 대 신호 강도)를 평가하고 선형 회귀 결과를 조직 영역에 적용하여 Na+ 함량을 정량화합니다.

면역 세포 활성화 연구: 조사관은 염분 민감성이 인간 단핵구의 활성화 상태와 관련이 있는지 여부를 결정할 것입니다. 헤파린 처리된 혈액 샘플(40ml)을 얻고 PBMC를 Ficoll-구배로 분리합니다. Miltenyi 단핵구 분리 키트를 사용하여 자기 표지 및 음성 선택에 의해 PBMC로부터 단핵구를 분리하고 유동 세포측정법을 사용하여 분석합니다. 그들은 단핵구를 CD45+/CD14+ 세포로 식별하고 중간(CD14+/CD16+ 및 비고전적 단핵구(CD14-/CD16+))을 추가로 검사할 수 있습니다. 순환계의 약 10%를 차지하는 CD14+/CD16+ 세포는 TNF알파 수준을 증가시키고 T 세포 활성화를 촉진하는 것이 특히 중요합니다. 이들은 고혈압이 있는 사람과 시험관 내 Na+ 노출 증가에 대한 반응으로 증가합니다. DC의 아형은 비교적 드물지만 연구자들은 CD45+/CD1c+, CD45+/CD141+, CD45+/CD209+, CD45+/CD83+ 및 최근 확인된 Axl/SICLEC6 세포를 측정하여 정량화할 것입니다. 7-AAD는 죽은 세포를 배제하는 데 사용됩니다. IsoLG-단백질 부가물을 검출하기 위해 단일 사슬 항체 D-11을 사용한 세포내 염색이 사용될 것이다. 성숙한 항원 제시 세포에서 발현되어 T 세포 공동 자극에 참여할 수 있도록 하는 CD80 및 CD86의 표면 발현을 측정할 것입니다. 총 백혈구(CD45+ 세포), B 세포(CD45+/CD19+), 총 T 세포(CD45+/CD3+ 세포) 및 T 세포 아형(CD3+/CD8+ 및 CD4+) 세포도 수행됩니다. 이 실험은 그림 2와 같이 염 민감성이 단핵구에 반영되는지 확인하기 위해 갓 분리된 세포와 정상 염 또는 고염에 48시간 동안 노출된 단핵구에서 수행됩니다. 48시간 동안 배양된 단핵구의 배지는 루미넥스를 사용하여 IL-1 베타, TNF-알파, IL-6 및 IL-23을 포함한 사이토카인 방출에 대해 분석했습니다. 조사관은 또한 단핵구를 DC로 전환시키는 역할을 하는 GM-CSF, IL-4 및 Flt3 리간드를 포함한 사이토카인을 평가하기 위해 혈장을 얻을 것입니다. 재현성을 보장하기 위해 샘플을 Vanderbilt Endocrinology and Metabolism Core Facility에 제출하여 블라인드 Luminex 분석을 수행합니다. p47phox의 인산화 및 p47phox와 gp91phox의 회합을 포함하는 NADPH 옥시다제의 O2-생산 및 활성화의 측정은 면역침전 및 웨스턴 블롯에 의해 베이스라인 및 증가된 Na+ 모두에서 이전에 기술된 바와 같이 수행될 것이다.