Sensibilidade ao Sal e Ativação de Células de Imunidade

Os investigadores empregarão o protocolo de Weinberger em 20 pacientes, conforme relatado anteriormente. Eles orientarão os participantes a manter sua dieta habitual e consumo de sal até o início do protocolo e fornecerão um recipiente e instruções apropriadas para coletar uma amostra de urina de 24 horas no dia anterior à admissão no hospital. A internação ocorrerá duas semanas depois, para eliminação do efeito das medicações, e à noite, para o paciente passar a noite em repouso no hospital antes de iniciar o protocolo. Durante essas duas semanas, a pressão arterial não tratada será monitorada pelos pacientes em casa ou em visitas intermediárias agendadas, para garantir que não ultrapasse 180/110 mmHg, caso em que o protocolo será interrompido por segurança. Na admissão, o volume da urina basal será medido e as alíquotas enviadas ao laboratório ou congeladas a -800C para análises de pesquisa. Na manhã após a admissão (6h), um monitor ambulatorial de pressão arterial (SpaceLabs 90207 ou 90210) será configurado para registro contínuo da pressão arterial durante todo o estudo (a cada 15 minutos, das 6h às 22h e a cada 30 minutos, das 22h às 6h), o peso corporal será registrado com o paciente vestindo um avental (mesma escala dos dias futuros), as amostras de sangue serão obtidas para os analitos do estudo descrito abaixo (testes de linha de base) e uma nova coleta de 24 horas será começou para o período de carregamento de sal às 8 horas. A carga de sal será obtida pela combinação de uma dieta hipersal (isocalórica, com 160 mEq Na e 70 mEq K), que o paciente consumirá integralmente, e uma infusão de 2L de soro fisiológico (300 mEq Na+). Os pacientes terão acesso gratuito à água, mas sua alimentação será limitada à fornecida pelo protocolo. Eles vão se retirar para a cama às 22h. Na manhã seguinte (6h) o peso corporal e as amostras de sangue serão novamente obtidos, e a coleta de 24 horas será concluída com uma micção intencional às 8h. Esses dados de laboratório refletirão o efeito da carga de sal. Às 8h, os indivíduos serão submetidos à depleção de sal. Isso é feito pela administração de uma dieta isocalórica contendo 10 mEq de Na e 70 mEq de K e ingestão contínua e ilimitada de água. Às 8h, 12h e 16h, os indivíduos receberão 40 mg de furosemida por via oral. Uma coleta adicional de urina de 12 horas será iniciada às 8h e encerrada com uma micção intencional às 20h (refletindo o período de natriurese por furosemida). Uma nova coleta de 12 horas começará às 20h, para ser encerrada com micção intencional na manhã seguinte às 8h (refletindo o período de esgotamento do sal). Na manhã seguinte (6h) será feito o último registro de peso corporal e coleta de amostras de sangue, e às 8h será concluída a coleta de urina de 12 horas para o período de depleção de sal. Os pacientes receberão café da manhã de uma dieta hospitalar regular, que pode ser suplementada com alimentos ou líquidos salgados se a intervenção de depleção de sal produzir tontura ou ortostase documentada. Uma vez estável e tolerante à postura ereta, o paciente receberá alta para casa com a orientação de retomar as medicações anti-hipertensivas, a menos que a presença de ortostase exija modificação do regime, o que será orientado pelo médico participante da pesquisa equipe.

Medições de sangue de laboratório: Os testes a serem realizados nos 3 conjuntos diários de amostras de sangue incluirão; hemogramas e químicas de rotina (incluindo creatinina sérica, Na+ e K+) no laboratório central do VUMC; Atividade da renina plasmática por radioimunoensaio; Aldosterona plasmática por radioimunoensaio; Ácidos eicosatrienóicos plasmáticos (EETs) e ácido 20-hidroxieicosatetraenóico (20-HETE) no núcleo eicosanóide de VUMC por cromatografia líquida/espectrometria de massa em tandem.

Análise de urina: Os testes a serem realizados nas 4 amostras de urina (linha de base de 24 horas, carregamento de sal de 24 horas, natriurese de furosemida de 12 horas e depleção de sal de 12 horas) incluirão; concentração de Na+, K+ e creatinina no laboratório central do VUMC; Urina ácidos eicosatrienóicos (EETs) e ácido 20-hidroxieicosatetraenóico (20-HETE) no núcleo eicosanóide de VUMC por cromatografia líquida/espectrometria de massa em tandem.

Definição da sensibilidade ao sal da pressão arterial: Serão baixados os dados da pressão arterial dos monitores e será utilizada como valor a média da pressão arterial sistólica do dia da carga de sal, das 12h (fim da infusão salina) até as 22h BP para o período de carregamento de sal do estudo. A média da pressão arterial sistólica do dia da depleção de sal, das 12h (segunda dose de furosemida) até as 22h será utilizada como PA para o período de depleção de sal do estudo. Uma queda na PA sistólica ≥10 mm Hg do carregamento de sal para os períodos de depleção de sal será usada para classificar um indivíduo como sensível ao sal.

Imagens de ressonância magnética de sódio: os investigadores detectarão de forma não invasiva o armazenamento de Na+ em tecidos humanos no Vanderbilt Imaging Institute. Eles quantificarão o conteúdo de Na+ na pele por ressonância magnética de 23Na com adesão rigorosa às abordagens relatadas anteriormente.6, 37, 38. A imagem é feita em um scanner Philips Achieva 3.0T MR (Philips Healthcare, Cleveland OH, EUA) com uma bobina de joelho de quadratura 23Na (Rapid Biomedical GmbH, Rimpar, Alemanha). Os investigadores usam fantomas de calibração (soluções aquosas com concentrações crescentes de NaCl) como padrões de referência e os digitalizam junto com seções dos músculos da panturrilha do sujeito para controle de qualidade. A parte inferior da perna esquerda (a parte mais larga da região da panturrilha) é escaneada com a pele em contato próximo com a superfície dura do suporte fantasma por 3 minutos e 52 segundos. Todos os dados de imagem são processados ​​off-line com scripts MATLAB (R2013a) personalizados. A quantificação de Na+ é realizada comparando as intensidades de sinal entre o tecido e os phantoms de calibração na imagem de Na+. Uma relação linear (concentração de Na+ versus intensidade do sinal) é avaliada com base nos dados do fantoma e os resultados de uma regressão linear são aplicados às regiões do tecido para quantificar o conteúdo de Na+.

Estudos de Ativação de Células Imunes: Os investigadores determinarão se a sensibilidade ao sal está associada ao estado de ativação de monócitos humanos. Amostras de sangue heparinizadas (40 ml) são obtidas e PBMCs são isoladas por gradiente de Ficoll. Os monócitos são isolados do PBMC por marcação magnética e seleção negativa usando o kit de isolamento de monócitos Miltenyi e analisados ​​usando citometria de fluxo. Eles identificam monócitos como células CD45+/CD14+ e podem examinar ainda monócitos intermediários (CD14+/CD16+ e não clássicos (CD14-/CD16+). As células CD14+/CD16+ que compreendem cerca de 10% da circulação, são de particular interesse pois produzem níveis aumentados de TNFalfa e promovem a ativação de células T. Estes estão aumentados em humanos com hipertensão e em resposta à exposição elevada de Na+ in vitro. Embora os subtipos de DCs sejam relativamente raros em número, os investigadores irão quantificá-los medindo CD45+/CD1c+, CD45+/CD141+, CD45+/CD209+, CD45+/CD83+ e as células Axl/SICLEC6 recentemente identificadas. 7-AAD é usado para excluir células mortas. A coloração intracelular com o anticorpo de cadeia simples D-11 para detectar adutos IsoLG-proteína será utilizada. A expressão de superfície de CD80 e CD86, que são expressas em células apresentadoras de antígeno maduras, permitindo que elas participem da coestimulação de células T, será medida. Caracterização geral de células mononucleares do sangue periférico por citometria de fluxo para outras células inflamatórias, incluindo leucócitos totais (células CD45+), células B (CD45+/CD19+), células T totais (células CD45+/CD3+) e o subtipo de células T (CD3+/CD8+ e células CD4+) também serão realizadas. Esses experimentos serão realizados em células recém-isoladas e também em monócitos expostos a sal normal ou alto sal por 48 horas para determinar se a sensibilidade ao sal é refletida nos monócitos, conforme mostrado na Fig. 2. Meio de monócitos cultivados por 48 horas é analisados ​​quanto à liberação de citocinas, incluindo IL-1 beta, TNF-alfa, IL-6 e IL-23 usando luminex. Os investigadores também obterão plasma para avaliar as citocinas, incluindo GM-CSF, IL-4 e o ligante Flt3, que são responsáveis ​​pela conversão de monócitos em DCs. Para garantir a reprodutibilidade, as amostras serão enviadas para a Vanderbilt Endocrinology and Metabolism Core Facility para realizar uma análise Luminex cega. Medições da produção de O2·- e ativação da NADPH oxidase incluindo fosforilação de p47phox e associação de p47phox com gp91phox por imunoprecipitação e western blot tanto na linha de base quanto em resposta a elevação de Na+ serão feitas anteriormente.