Sensibilità al sale e attivazione delle cellule immunitarie

Gli investigatori impiegheranno il protocollo Weinberger in 20 pazienti come riportato in precedenza. Consiglieranno ai partecipanti di mantenere la loro dieta abituale e il consumo di sale fino all'inizio del protocollo e fornire loro un contenitore e istruzioni appropriate per raccogliere un campione di urina delle 24 ore il giorno prima del ricovero in ospedale. Il ricovero avverrà due settimane dopo, per l'eliminazione dell'effetto dei farmaci, e una sera, affinché il paziente riposi durante la notte in ospedale prima dell'inizio del protocollo. Durante queste due settimane, la pressione arteriosa non trattata sarà monitorata dai pazienti a casa o in visite intermedie programmate, per assicurarsi che non superi 180/110 mmHg, nel qual caso il protocollo verrà interrotto per sicurezza. Al momento del ricovero, verrà misurato il volume dell'urina di base e le aliquote verranno inviate al laboratorio o congelate a -80°C per gli analiti di ricerca. La mattina dopo il ricovero (6:00) verrà installato un monitor ambulatoriale della pressione sanguigna (SpaceLabs 90207 o 90210) per la registrazione continua della pressione sanguigna durante lo studio (ogni 15 minuti dalle 6:00 alle 22:00 e ogni 30 minuti dalle 22:00 alle 6 am), verrà registrato il peso corporeo con il paziente che indossa un camice (stessa scala dei giorni successivi), verranno prelevati campioni di sangue per gli analiti dello studio descritti di seguito (test di riferimento) e verrà effettuata una nuova raccolta di 24 ore iniziato per il periodo di carico del sale alle 8 del mattino. Il carico di sale sarà ottenuto dalla combinazione di una dieta ricca di sale (isocalorica, con 160 mEq Na e 70 mEq K), che il paziente consumerà nella sua interezza, e un'infusione di 2L di soluzione salina (300 mEq Na+). I pazienti avranno libero accesso all'acqua ma il loro cibo sarà limitato a quello previsto dal protocollo. Si ritireranno a letto alle 22:00. La mattina seguente (6:00) verranno nuovamente prelevati il ​​peso corporeo e i campioni di sangue e la raccolta delle 24 ore sarà completata con uno svuotamento intenzionale alle 8:00. Questi dati di laboratorio rifletteranno l'effetto del carico di sale. Alle 8 del mattino i soggetti saranno sottoposti a deplezione salina. Ciò si ottiene somministrando una dieta isocalorica contenente 10 mEq Na e 70 mEq K e continuando un'assunzione illimitata di acqua. Alle 8:00, 12:00 e 16:00, ai soggetti verranno somministrati 40 mg di furosemide per via orale. Un'ulteriore raccolta delle urine di 12 ore inizierà alle 8:00 e terminerà con un vuoto intenzionale alle 20:00 (che riflette il periodo di furosemide natriuresi). Una nuova raccolta di 12 ore inizierà alle 20:00, per essere chiusa con svuotamento intenzionale la mattina successiva alle 8:00 (che riflette il periodo di esaurimento del sale). La mattina successiva (6:00) avverrà l'ultima registrazione del peso corporeo e il prelievo dei campioni di sangue, ed entro le 8:00 sarà completata la raccolta delle urine delle 12 ore per il periodo di deplezione salina. Ai pazienti verrà somministrata la colazione da una normale dieta ospedaliera, che può essere integrata con cibi o liquidi salati se l'intervento di esaurimento del sale ha prodotto vertigini o ortostasi documentata. Una volta che il paziente è stabile e mostra tolleranza alla postura eretta, verrà dimesso a casa con istruzioni per riprendere i farmaci antipertensivi, a meno che la presenza di ortostasi non richieda una modifica del regime, che sarà consigliata da un medico membro della ricerca squadra.

Misurazioni del sangue di laboratorio: i test da condurre nei 3 set giornalieri di campioni di sangue includeranno; CBC e test chimici di routine (inclusi creatinina sierica, Na+ e K+) presso il laboratorio centrale del VUMC; Attività della renina plasmatica mediante dosaggio radioimmunologico; Aldosterone plasmatico mediante dosaggio radioimmunologico; Acidi eicosatrienoici plasmatici (EET) e acido 20-idrossiicosatetraenoico (20-HETE) nel nucleo eicosanoide di VUMC mediante cromatografia liquida/spettrometria di massa tandem.

Analisi delle urine: i test da condurre nei 4 campioni di urina (basale di 24 ore, carico di sale di 24 ore, natriuresi di furosemide di 12 ore e deplezione di sale di 12 ore) includeranno; Concentrazione di Na+, K+ e creatinina presso il laboratorio centrale del VUMC; Acidi eicosatrienoici delle urine (EET) e acido 20-idrossieicosatetraenoico (20-HETE) nel nucleo eicosanoide di VUMC mediante cromatografia liquida/spettrometria di massa tandem.

Definizione della sensibilità al sale della pressione arteriosa: i dati della pressione arteriosa dai monitor verranno scaricati e la media della pressione arteriosa sistolica del giorno del caricamento del sale, dalle 12:00 (fine dell'infusione salina) fino alle 22:00 verrà utilizzata come BP per il periodo di studio carico di sale. La media della pressione arteriosa sistolica del giorno della deplezione di sale, da mezzogiorno (seconda dose di furosemide) fino alle 22:00 sarà utilizzata come BP per il periodo di studio con deplezione di sale. Una caduta della PA sistolica ≥10 mm Hg dai periodi di carico di sale a quelli di deplezione di sale verrà utilizzata per classificare un soggetto come sensibile al sale.

Imaging con risonanza magnetica del sodio: gli investigatori rileveranno in modo non invasivo l'accumulo di Na + nei tessuti umani presso l'istituto di imaging Vanderbilt. Quantificheranno il contenuto di Na+ nella pelle mediante 23Na MRI con rigorosa aderenza agli approcci precedentemente riportati.6, 37, 38. L'imaging viene eseguito su uno scanner RM Philips Achieva 3.0T (Philips Healthcare, Cleveland OH, USA) con una bobina per ginocchio in quadratura 23Na (Rapid Biomedical GmbH, Rimpar, Germania). Gli investigatori usano fantocci di calibrazione (soluzioni acquose con concentrazioni crescenti di NaCl) come standard di riferimento e li scansionano insieme a sezioni attraverso i muscoli del polpaccio del soggetto per il controllo di qualità. La parte inferiore della gamba sinistra (la parte più ampia della regione del polpaccio) viene scansionata con la pelle a stretto contatto con la superficie dura del portafantoccio per 3 minuti e 52 secondi. Tutti i dati di imaging vengono elaborati off-line con script MATLAB (R2013a) personalizzati. La quantificazione del Na+ viene eseguita confrontando le intensità del segnale tra tessuto e fantocci di calibrazione sull'immagine del Na+. Una relazione lineare (concentrazione di Na+ rispetto all'intensità del segnale) viene valutata in base ai dati fantasma e i risultati di una regressione lineare vengono applicati alle regioni tissutali per quantificare il contenuto di Na+.

Studi sull'attivazione delle cellule immunitarie: i ricercatori determineranno se la sensibilità al sale è associata allo stato di attivazione dei monociti umani. Si ottengono campioni di sangue eparinizzato (40 ml) e le PBMC vengono isolate mediante gradiente di Ficoll. I monociti vengono isolati dal PBMC mediante etichettatura magnetica e selezione negativa utilizzando il kit di isolamento dei monociti Miltenyi e analizzati mediante citometria a flusso. Identificano i monociti come cellule CD45+/CD14+ e possono esaminare ulteriormente monociti intermedi (CD14+/CD16+ e non classici (CD14-/CD16+). Le cellule CD14+/CD16+, che costituiscono circa il 10% della circolazione, sono di particolare interesse perché producono un aumento dei livelli di TNFalfa e promuovono l'attivazione delle cellule T. Questi sono aumentati negli esseri umani con ipertensione e in risposta all'elevata esposizione di Na+ in vitro. Sebbene i sottotipi di DC siano relativamente rari, i ricercatori li quantificheranno misurando CD45+/CD1c+, CD45+/CD141+, CD45+/CD209+, CD45+/CD83+ e le cellule Axl/SICLEC6 recentemente identificate. 7-AAD viene utilizzato per escludere le cellule morte. Verrà utilizzata la colorazione intracellulare con l'anticorpo a catena singola D-11 per rilevare gli addotti della proteina IsoLG. Verrà misurata l'espressione superficiale di CD80 e CD86, che sono espressi su cellule presentanti l'antigene mature permettendo loro di partecipare alla co-stimolazione delle cellule T. Caratterizzazione generale delle cellule mononucleate del sangue periferico mediante citometria a flusso per altre cellule infiammatorie inclusi leucociti totali (cellule CD45+), cellule B (CD45+/CD19+), cellule T totali (cellule CD45+/CD3+) e il sottotipo di cellule T (CD3+/CD8+ e Verranno eseguite anche cellule CD4+). Questi esperimenti saranno eseguiti in cellule appena isolate e anche in monociti esposti a sale normale o ad alto contenuto di sale per 48 ore per determinare se la sensibilità al sale si riflette nei monociti come mostrato in Fig. 2. Il terreno da monociti coltivati ​​per 48 ore è analizzato per il rilascio di citochine tra cui IL-1 beta, TNF-alfa, IL-6 e IL-23 utilizzando luminex. Gli investigatori otterranno anche plasma per valutare le citochine tra cui GM-CSF, IL-4 e ligando Flt3 che sono responsabili della conversione dei monociti in DC. Per garantire la riproducibilità, i campioni saranno inviati alla Vanderbilt Endocrinology and Metabolism Core Facility per eseguire un'analisi Luminex in cieco. Le misurazioni della produzione di O2·- e dell'attivazione della NADPH ossidasi, compresa la fosforilazione di p47phox e l'associazione di p47phox con gp91phox mediante immunoprecipitazione e western blot sia al basale che in risposta a livelli elevati di Na+, saranno effettuate in precedenza.