Чувствительность к соли и активация иммунных клеток

Как сообщалось ранее, исследователи будут использовать протокол Вайнбергера у 20 пациентов. Они посоветуют участникам придерживаться своей обычной диеты и потребления соли до начала протокола и предоставят им контейнер и соответствующие инструкции для сбора 24-часового образца мочи за день до поступления в больницу. Госпитализация будет проходить через две недели для вымывания эффекта лекарств и вечером, чтобы пациент отдохнул в больнице в течение ночи перед началом протокола. В течение этих двух недель нелеченное артериальное давление будет контролироваться либо пациентами дома, либо во время промежуточных плановых визитов, чтобы убедиться, что оно не превышает 180/110 мм рт.ст., и в этом случае протокол будет прекращен из соображений безопасности. При поступлении будет измерен объем исходной мочи, а аликвоты отправлены в лабораторию или заморожены при -800°C для исследовательских аналитов. На утро после госпитализации (6:00) будет установлен амбулаторный тонометр (SpaceLabs 90207 или 90210) для непрерывной регистрации артериального давления на протяжении всего исследования (каждые 15 минут с 6:00 до 22:00 и каждые 30 минут с 22:00 до 22:00). 6:00), масса тела будет зарегистрирована у пациента, одетого в халат (та же шкала, что и в последующие дни), будут получены образцы крови для анализа аналитов исследования, описанного ниже (исходные тесты), и будет проведен новый 24-часовой сбор. началась на период солевой загрузки в 8 утра. Солевая нагрузка будет достигнута за счет сочетания диеты с высоким содержанием соли (изокалорийной, с 160 мэкв Na и 70 мэкв K), которую пациент будет потреблять полностью, и инфузии 2 л физиологического раствора (300 мэкв Na+). Пациенты будут иметь свободный доступ к воде, но их питание будет ограничено тем, что предусмотрено протоколом. Они отправятся спать в 10 часов вечера. На следующее утро (6:00) снова будут получены образцы массы тела и крови, а 24-часовой сбор будет завершен преднамеренным мочеиспусканием в 8:00. Эти лабораторные данные будут отражать влияние солевой нагрузки. В 8 утра субъекты будут подвергаться солевому истощению. Это достигается введением изокалорийной диеты, содержащей 10 мэкв Na и 70 мэкв K, и продолжительным неограниченным потреблением воды. В 8:00, 12:00 и 16:00 испытуемым давали 40 мг фуросемида перорально. Дополнительный 12-часовой сбор мочи будет начинаться в 8 часов утра и заканчиваться преднамеренным мочеиспусканием в 8 часов вечера (что отражает период натрийуреза фуросемида). Новый 12-часовой сбор начнется в 20:00 и будет закрыт преднамеренным мочеиспусканием на следующее утро в 8:00 (что отражает период истощения солей). На следующее утро (6 часов утра) состоится последний учет массы тела и взятие проб крови, а к 8 часам утра завершится 12-часовой сбор мочи на период солевого истощения. Пациентам будет даваться завтрак из обычной больничной диеты, которая может быть дополнена соленой пищей или жидкостями, если вмешательство по истощению солей вызвало головокружение или задокументированный ортостаз. Как только пациент стабилизируется и проявит толерантность к вертикальному положению, его/ее выпишут домой с инструкциями возобновить прием антигипертензивных препаратов, если только наличие ортостаза не требует изменения режима, который будет рекомендован врачом-участником исследования. команда.

Лабораторные измерения крови: Анализы, которые будут проводиться в 3 ежедневных наборах образцов крови, будут включать: Общий анализ крови и рутинные биохимические анализы (включая сывороточный креатинин, Na+ и K+) в центральной лаборатории VUMC; Активность ренина плазмы с помощью радиоиммуноанализа; Альдостерон плазмы с помощью радиоиммуноанализа; Плазменные эйкозатриеновые кислоты (EET) и 20-гидроксиэйкозатетраеновая кислота (20-HETE) в эйкозаноидном ядре VUMC с помощью жидкостной хроматографии / тандемной масс-спектрометрии.

Анализ мочи: тесты, которые будут проводиться в 4 образцах мочи (24-часовой исходный уровень, 24-часовая солевая нагрузка, 12-часовой фуросемидный натрийурез и 12-часовое истощение солей), будут включать: концентрация Na+, K+ и креатинина в центральной лаборатории ВУМЦ; Эйкозатриеновые кислоты в моче (EET) и 20-гидроксиэйкозатетраеновая кислота (20-HETE) в эйкозаноидном ядре VUMC с помощью жидкостной хроматографии/тандемной масс-спектрометрии.

Определение чувствительности артериального давления к соли: данные артериального давления будут загружены с мониторов, а среднее значение систолического артериального давления в день нагрузки солью, с 12:00 (окончание инфузии физиологического раствора) до 22:00, будет использоваться в качестве АД на солевой период исследования. Среднее значение систолического артериального давления в день истощения солей, с 12 часов дня (вторая доза фуросемида) до 22 часов, будет использоваться в качестве АД для периода истощения солей. Падение систолического АД ≥10 мм рт. ст. от периода солевой нагрузки до периодов истощения солей будет использоваться для классификации субъекта как чувствительного к соли.

Визуализация МРТ натрия: исследователи будут неинвазивно обнаруживать запасы Na+ в тканях человека в Институте визуализации Вандербильта. Они будут количественно определять содержание Na+ в коже с помощью 23Na МРТ со строгим соблюдением ранее описанных подходов.6, 37, 38. Визуализация проводится на МРТ-сканере Philips Achieva 3.0T (Philips Healthcare, Кливленд, Огайо, США) с квадратурной коленной катушкой 23Na (Rapid Biomedical GmbH, Rimpar, Германия). Исследователи используют калибровочные фантомы (водные растворы с увеличивающейся концентрацией NaCl) в качестве эталонных стандартов и сканируют их вместе со срезами икроножных мышц субъекта для контроля качества. Левая голень (самая широкая часть икроножной области) сканируется при тесном контакте кожи с твердой поверхностью держателя фантома в течение 3 минут и 52 секунд. Все данные изображений обрабатываются в автономном режиме с помощью пользовательских сценариев MATLAB (R2013a). Количественное определение Na+ выполняется путем сравнения интенсивности сигнала между тканевым и калибровочным фантомами на изображении Na+. Линейная зависимость (концентрация Na+ от интенсивности сигнала) оценивается на основе данных фантома, а результаты линейной регрессии применяются к участкам ткани для количественного определения содержания Na+.

Исследования активации иммунных клеток: Исследователи определят, связана ли чувствительность к соли с состоянием активации моноцитов человека. Получают гепаринизированные образцы крови (40 мл) и выделяют РВМС с помощью фиколл-градиента. Моноциты выделяют из РВМС с помощью магнитной метки и негативной селекции с использованием набора для выделения моноцитов Miltenyi и анализируют с помощью проточной цитометрии. Они идентифицируют моноциты как клетки CD45+/CD14+ и могут дополнительно исследовать промежуточные (CD14+/CD16+ и неклассические моноциты (CD14-/CD16+). Клетки CD14+/CD16+, которые составляют около 10% циркуляции, представляют особый интерес, они продуцируют повышенные уровни TNF-альфа и способствуют активации Т-клеток. Они увеличиваются у людей с гипертонией и в ответ на повышенное воздействие Na+ in vitro. Хотя подтипы ДК относительно редки, исследователи определят их количество путем измерения клеток CD45+/CD1c+, CD45+/CD141+, CD45+/CD209+, CD45+/CD83+ и недавно идентифицированных клеток Axl/SICLEC6. 7-AAD используется для исключения мертвых клеток. Будет использовано внутриклеточное окрашивание одноцепочечным антителом D-11 для обнаружения аддуктов IsoLG-белка. Будет измеряться поверхностная экспрессия CD80 и CD86, которые экспрессируются на зрелых антигенпрезентирующих клетках, что позволяет им участвовать в костимуляции Т-клеток. Общая характеристика мононуклеарных клеток периферической крови с помощью проточной цитометрии для других воспалительных клеток, включая общее количество лейкоцитов (клетки CD45+), В-клетки (CD45+/CD19+), общее количество Т-клеток (клетки CD45+/CD3+) и подтип Т-клеток (CD3+/CD8+ и CD4+) клетки также будут выполнены. Эти эксперименты будут проводиться на свежеизолированных клетках, а также на моноцитах, подвергнутых воздействию нормальной соли или высокой концентрации соли в течение 48 часов, чтобы определить, отражается ли чувствительность к соли в моноцитах, как показано на рис. 2. Среда из моноцитов, культивируемых в течение 48 часов, анализировали на высвобождение цитокинов, включая IL-1 бета, TNF-альфа, IL-6 и IL-23, с использованием люминекса. Исследователи также получат плазму для оценки цитокинов, включая GM-CSF, IL-4 и лиганд Flt3, которые отвечают за превращение моноцитов в DC. Чтобы обеспечить воспроизводимость, образцы будут отправлены в Центральный центр эндокринологии и метаболизма Вандербильта для проведения слепого анализа Luminex. Измерения продукции O2·- и активации NADPH-оксидазы, включая фосфорилирование p47phox и связь p47phox с gp91phox, с помощью иммунопреципитации и вестерн-блоттинга как на исходном уровне, так и в ответ на повышенный уровень Na+, будут выполнены ранее, как описано.