右半结肠癌和结肠腺瘤患者使用磷霉素和甲硝唑进行术前内镜治疗（MEFO 试验） (MEFO)

背景 生态失调和已知的细菌驱动因素在结直肠癌的致癌作用中起着重要作用。 在细菌驱动因素中，具核梭杆菌 (FN) 和结肠上皮表面生物膜的形成被认为是致癌物质。 粘膜层通透性增加以及结肠隐窝和粘膜下空间中的入侵细菌导致遗传和表观遗传变化以及免疫反应，这些都是重要的致癌因素。 临床研究发现，几乎所有右侧结肠癌和腺瘤都有生物膜形成和 FN 阳性染色。 两项研究比较了患有和未患有腺瘤的患者正常粘膜中的细菌生长情况。 他们在丰富度、多样性和细菌菌株方面发现正常粘膜中的细菌组成与腺瘤患者不同，因此表明肠道中的细菌组成可能有助于腺瘤和随后的腺癌的生长。

生物膜和肿瘤的内窥镜术前局部抗生素治疗理论上会导致肿瘤质量减少、粘膜层恢复以及结肠治疗部分的免疫反应正常化。 在小鼠中口服抗生素甲硝唑已被证明可以减少肿瘤生长（FN 阳性异种移植肿瘤）以及肿瘤内 FN 丰度的降低。

研究药物 在这项研究中，将使用内窥镜将含有抗生素磷霉素和甲硝唑的凝胶喷洒在右半结肠的粘膜上。 凝胶将通过将磷霉素和甲硝唑的溶液与凝胶形成胶混合来现场制备。

研究目标 本研究的目的是研究局部抗生素治疗（磷霉素和甲硝唑）对右侧结肠癌或右侧结肠腺瘤患者的肿瘤特征和结肠生物膜的影响。

研究设计 本研究是一项临床概念验证干预研究。 它基于具有开放标签单组分配的非随机试验设计。 根据肿瘤的病理，有两个轨道：轨道 1，右侧结肠癌患者；轨迹 2a，右侧结肠腺瘤患者。 干预是一种治疗性内窥镜检查，其中抗生素磷霉素和甲硝唑以凝胶形成混合物的形式喷洒在从盲肠到右结肠弯曲的整个右结肠部分。 患者将包括来自 Herlev 医院和新西兰大学医院外科的患者。 将有一个结肠腺瘤患者的回顾性队列，轨道 2b。

效果参数 对于患有右侧结肠癌和/或腺瘤的患者，研究人员假设使用含有磷霉素和甲硝唑的凝胶形成喷雾剂在右侧结肠进行内窥镜术前抗生素治疗将导致结肠上皮细胞和免疫反应正常化，因为以及在这些患者中常见的结肠生物膜形成减少。

试验结构和职责 主要研究者 (Astrid Bennedsen) 负责准备方案、病例报告表 (CRF)、协调安全数据监测委员会的任何会议以及在试验的日常运作中实施决策。 首席调查员将与一组合作调查员一起进行 CRF 的筛选、招募、数据收集和撰写。 安全数据监测委员会由三名成员组成，将保持公正。 他们将概述试验的进展和安全性。 安全数据监测委员会会议将每六个月举行一次，但如果在试验期间出现任何严重不良事件或任何其他严重事件，将额外召开一次会议。 试验将由当地的 GCP 单位监督。 资金来源在本研究的设计中没有任何作用，在其执行、分析、数据解释或决定提交结果的过程中也不会发挥任何作用。

停止规则 如果出现严重的副作用或不良事件，将监测数据，如果有任何证据表明干预和研究药物缺乏安全性，则停止试验。 包括与结肠癌手术有关的意外并发症。

学习课程 本研究根据结肠肿瘤的病理学有两个方向。 当怀疑患有结肠癌时，患者会被转诊进行结肠镜检查，在此期间进行活组织检查以确认表明腺癌或良性病理的病理学。 有一个回顾性轨道 2b，研究人员将从 2018 年接受内窥镜粘膜切除术的多达 28 名随机患者中取出 FFPE 腺瘤组织。 试验药物将按地点和每位患者计算在内。

参与者的选择和入组经内窥镜诊断为右侧结肠腺瘤或右侧结肠癌肿瘤的连续患者将符合纳入研究的条件。 研究人员计划纳入 14 名结肠癌患者（第 1 轨）和 14 名结肠腺瘤患者（第 2a 轨）。

此外，还将回顾性纳入 28 名结肠腺瘤患者（轨道 2b）。 研究人员将从切除的带有腺瘤的粘膜中取出 FFPE 组织。 他们于 2018 年在西兰大学医院外科进行了内窥镜粘膜切除术。

患者的招募将根据研究伦理委员会的建议连续进行。 符合纳入条件的患者将收到有关该研究的口头和书面信息。 在登记会议结束时，如果患者愿意，可以签署知情同意书，也可以给予考虑所需的时间（至少 24 小时）。 知情同意书将根据丹麦法律书写。 如果研究发生任何变化，患者将被告知，因为这可能会影响患者参与的意愿或参与患者的安全。 批准的文件将相应更新。

一个完成测试的人

一个完整的测试人员定义为：

• Track 1：接受治疗性内窥镜检查并在手术当天抽取术前血样的患者。 除了门诊就诊当天（大约术后第 14 天）的访谈外，没有对患者进行进一步的与研究相关的身体随访。
• 轨道 2a：接受治疗性内窥镜检查并在手术当天抽取术前血样的患者。 除了术后第 14 天的电话采访外，没有对患者进行进一步的与研究相关的身体随访。

退出程序退出和退出可以发生在从书面同意书到手术当天的术前血液样本的任何时候，并且不会对患者的治疗产生任何影响。

参与的患者可以出于任何原因随时退出研究。 根据赫尔辛基宣言，患者将被告知这项权利。

如果研究者认为参与研究会危及患者的安全，研究者可以撤回患者。 在这种情况下，研究者必须告知患者退出的原因。

撤回同意的患者将接受标准治疗。 退出的原因（如果有说明）将在 CRF 中注明。 将报告辍学和退出的人数。 不会从退出研究的患者中收集更多数据；但是，之前收集的数据将作为最终数据分析的一部分，除非患者特别要求删除所有数据。

研究干预和程序 干预 这是一项非随机试验，采用开放标签单组分配。 干预是一种单一的治疗性内窥镜检查，在此期间，患者的右结肠部分将被喷洒预定体积的两种成分溶液，一种含有磷霉素和甲硝唑，另一种含有与前者混合时形成凝胶的口香糖。 在管理期间，这两个组件将通过双通道结肠内窥镜传送。 凝胶将在肠壁上形成并粘附在粘膜上。

轨道 1：结肠癌患者 术前程序 - 血样 在治疗性内窥镜检查研究当天，抽取血样。 分析血样的血红蛋白 (Hb)、白细胞和分类计数、c-反应蛋白 (CRP)、血小板、白蛋白、肌酐、估计肾小球滤过率 (eGFR)、转氨酶，以获得患者的基线信息并进行评估能够在多变量分析中针对这些变量进行调整。 还将分析血液样本中的肿瘤特异性标记物：癌胚抗原 (CEA)。 样本也通过 nCounter® PanCancer Immune Profiling Panel (nanoString) 进行分析。

术前程序 - 治疗性内窥镜检查 在患者知情同意参与研究后至少 24 小时，将对患者进行肠道准备。 48-72 小时后，将进行治疗性内窥镜检查。 肠道准备程序将遵循不同地点使用 Picoprep 进行肠道准备的标准指南。 在内窥镜检查之前，患者将被给予镇静剂。 在内窥镜检查期间将拍摄结肠照片。

在喷射右半结肠之前，将从肿瘤的中央和周围部分进行活组织检查，并且从口腔和肛门距肿瘤至少 10 cm 的近端结肠中的肉眼可见的正常粘膜进行活组织检查。

使用视频结肠镜通过双喷雾导管从回肠向右弯曲部喷洒预定体积的研究药物。 研究药物含有磷霉素和甲硝唑，它们与代表 Reponex Pharmaceuticals A/S 配制的凝胶形成成分原位混合。

术前程序 - 病理学 治疗性内窥镜检查期间采取的一些活检将全部直接固定在磷酸盐缓冲（PBS 缓冲）福尔马林中，并在进行显微镜评估和进一步的分子生物学或免疫学测试之前包埋在石蜡中。 一份来自健康粘膜的活检、一份来自肿瘤中心的活检和一份来自肿瘤周边的活检将按照当地方案立即冷冻。

手术 手术当天，将再次采集血样。 他们将使用与术前血液样本相同的方法进行分析。 纳入研究不会干扰右侧结肠癌患者的标准手术方案。

术后程序 - 病理学 切除的结肠切片将不固定地送到现场的病理科，在那里进行初步的宏观评估：肿瘤测量、淋巴结评估等。 一份来自健康粘膜的组织样本、一份来自肿瘤中心的组织样本和一份来自肿瘤周围的组织样本将按照当地方案立即冷冻。 然后将半结肠用福尔马林固定。 在进行显微镜评估和进一步的分子生物学或免疫学测试之前，将根据标准方案切割石蜡包埋的肿瘤样本。 组织学评估将遵循标准方案。

出院 纳入研究的患者的出院标准与病房中其他患者的出院标准相同。 如果没有出现并发症，预计在术后第 3 天出院。 延长住院时间定义为手术后 10 天。

术后门诊就诊 - 随访 患者将在术后门诊就诊后就诊。 研究人员将评估患者的健康状况，并确保对试验中药物的任何副作用或不良反应进行登记。

术后 12 个月将通过电话联系患者。 没有对患者进行进一步研究相关的身体随访，因为它对终点没有影响。 然而，研究人员将在 12 个月后阅读患者的医院档案，以了解治疗性内窥镜检查是否改变了患者的临床过程，即分期和肿瘤治疗是否因手术而改变。 根据丹麦结直肠癌组 (DCCG) 的建议，患者正在接受标准的术后计划和门诊随访。

第 2 道：结肠腺瘤性息肉患者 术前程序 - 血样 在治疗性内窥镜检查当天，抽取研究血样。 它们将采用与第 1 道术前血样相同的方法进行分析。

术前程序 - 治疗性内窥镜检查 肠道准备程序和镇静与轨道 1 相同。内窥镜检查期间将拍摄肿瘤照片。

在喷洒右半结肠之前，从息肉的口腔和肛门至少 10 厘米处取宏观正常粘膜的活组织检查。

喷涂程序与轨道 1 相同。

术前程序 - 病理学 治疗性内窥镜检查期间对正常粘膜进行的四份活检中的三份将全部直接固定在 PBS 缓冲的福尔马林中，并在进行显微镜评估和进一步的分子生物学或免疫学测试之前包埋在石蜡中。 正常粘膜的一份活检将按照当地规程立即冷冻。

切除 在切除当天，将再次采集血样。 它们将通过与术前血液样本相同的方法进行分析。 在内窥镜粘膜切除术中，将对健康结肠进行活检：两个 10 cm 口部活检和两个 10 cm 肛门息肉活检。

术后程序 - 病理学 手术期间对正常粘膜进行的四份活检中的三份将全部直接固定在 PBS 缓冲福尔马林中。 正常粘膜的一份活检将按照当地规程立即冷冻。 带有腺瘤的切除粘膜将被非固定地送到现场的病理科，在那里进行初步的宏观评估，在三个维度上测量息肉。 粘膜和活组织检查将用福尔马林固定，并根据标准方案进行切割和石蜡包埋，然后进行显微镜评估和进一步的分子生物学或免疫学测试。 组织学评估将遵循标准方案。

随访 在术后第 14+/-2 天，研究人员将致电患者评估患者的健康状况，并确保记录试验中药物的任何副作用或不良反应。 跟进与轨道 1 中一样。

来自结肠腺瘤患者的存档 FFPE 组织 来自结肠腺瘤的 FPPE 组织块将从新西兰大学医院病理学系的档案中检索。 将根据标准方案切割组织块。 它们将作为轨道 2a 中包括的患者的切除粘膜组织进行分析。

两条轨道的病理学程序石蜡块将被连续切片。 在每个步骤中，第 1 节用标准苏木精和伊红 (H&E) 染色，第 3 节对 CD8 和 CD3 进行免疫组织化学染色（遵循局部免疫评分协议），第 5 节将对 CD68（巨噬细胞）进行染色。 第 7、9 和 11 节将使用一般细菌 PNA FISH 探针分析细菌生物膜。 第 13 节将按照 nanoString 协议为 PanCancer IO 360TM 基因表达面板 (nanoString) 分析做准备。 其余部分（2、4、6、8、10 和 12）保持未染色，并将保存在 -80°C。

两条轨道的微生物学程序 在这项研究中，将使用荧光原位杂交和宏基因组测序分析组织样本中的细菌和生物膜。 这些分析将在科斯特顿生物膜中心进行。

安全性评估 在这项研究中，患者服用标准单剂量的研究药物，即 800 mg 磷霉素和 200 mg 甲硝唑。 接受磷霉素输注治疗的成人的一般剂量指南是每天 6 g*3（对于肾功能不全和肌酐清除率为 10 ml/min 的患者，建议剂量是每天 1 g*2）。 甲硝唑治疗的一般剂量指南是单次输注 1500 毫克。

血液样本 抽取血液样本会导致一些不适，并可能在现场造成瘀伤。 总共 8.5mL 将在西兰大学医院、Roskilde 和 Herlev 医院抽取（3.0 mL 凝胶 + LiHep 管 + 3.0 mL EDTA 管 + 2.5 mL PAXgene 血液 RNA 管）。 总共 11.5 mL 将在以下地点抽取：Køge 西兰大学医院（3.0 mL 凝胶 + LiHep 管 + 3.0 mL 凝胶 + LiHep 管 + 3.0 mL EDTA 管 + 2.5 mL PAXgene 血液 RNA 管）。

治疗性内窥镜检查：

在这项研究中，完整的结肠镜检查对于将研究药物递送至右半结肠的粘膜是必要的。 此外，为了评估局部抗生素治疗的效果，有必要对健康粘膜进行活检，如果患者包含在轨道 1 中，还包括结肠癌肿瘤。 在结肠镜检查前 48-72 小时，患者需要进行肠道准备 (15)。 结肠镜检查存在相关风险：肠道出血、肠穿孔、局部感染、对镇静剂的不良反应和全身性肠道感染。 其中，肠道出血和医源性肠穿孔是与显着死亡率和手术干预需求相关的最突出的不良事件。 意外肠穿孔的风险估计为 0.85/1000，出血风险估计为 1.64/1000 (16)。 然而，并发症在不涉及息肉切除术的结肠镜检查中不太常见，例如本研究。 结肠镜检查将由经过培训的专科外科医生在门诊进行。 由于已知过敏或合并症而无法镇静的患者已被排除在研究参与之外。

不良事件 在磷霉素和甲硝唑给药期间和之后，将报告任何不良事件或并发疾病。 已知对磷霉素和/或甲硝唑过敏的患者被排除在研究参与之外。 已知使用甲硝唑治疗会在继续饮酒的患者中引起 Antabuse（双硫仑）样反应。 目前酗酒的患者被排除在研究参与之外。 在登记会议期间，将口头指示患者从治疗性内窥镜检查前一天起不要饮酒。 此信息包含在患者信息中。 总结磷霉素和甲硝唑的产品特性，可作为不良反应评价的参考资料。 研究人员将从干预当天到术后第 14 天（总共约 19 天）监测不良事件。 干预的安全性将通过不良事件来衡量。

所有严重不良事件 (SAE) 将在事件记录后 24 小时内由研究者登记并报告给赞助商。 所有不良事件都将在年度报告中报告给丹麦药品管理局和当地伦理委员会，并附有关于试验患者安全性的报告。 所有严重不良反应 (SAR) 都将在年度报告中与患者安全报告一起报告给丹麦药品管理局。 所有SAR将通过产品概要判断是否可能是疑似非预期严重不良反应（SUSAR）。 研究人员有责任尽快且不迟于收到此类反应的 7 天后向丹麦药品管理局和地区伦理委员会报告所有致命或危及生命的 SUSAR。 最迟在报告后 8 天后，丹麦药品管理局将获知后续情况。 所有其他 SUSAR 将在申办者和研究者收到信息后的 15 天内报告给丹麦药品管理局和地区伦理委员会。 在这些情况下，将通过医院门诊或通过与申办方或研究人员联系，跟踪患者直至反应终止。

统计学考虑 研究人员计划纳入 14 名连续的右侧结肠腺瘤患者和 14 名连续的右侧结肠癌患者。 试验将在最后一位患者的最后一次就诊时结束。 28 名结肠腺瘤患者（轨道 2b）的回顾性队列将与 14 名右侧结肠腺瘤患者（轨道 2a）的前瞻性队列以 2:1 的比例匹配。 调查人员估计辍学率为 15%。 因此，纳入将在第 24 名完全可评估的患者前停止。 这是一项临床概念验证干预研究，据我们所知，研究人员是第一个研究结肠癌或结肠腺瘤患者生物膜局部抗生素治疗的小组。 研究人员希望这一数量的患者足以提供实施该技术的必要经验，并为未来的研究奠定基础，包括他们的样本量计算。

将根据数据的分布使用非参数统计或参数统计分析数据。 P 值 <0.05 被认为是显着的。 如果需要，将执行多重比较校正。 描述性统计数据将用于基线特征。 将进行主要意向治疗分析和符合方案分析，以及标准敏感性分析。 将通过敏感性分析评估任何缺失数据的影响。 缺失的数据将通过创建临床负责的插补来解决。 研究人员将专注于使用监督分析（统计检验，如 t 检验或 Wilcoxon 检验）和非监督分析（如 PCA（主成分分析）和 ICA（独立成分分析））发现分子特征。 统计将与生物统计学家 Nicolas Derian 合作进行。

在息肉的术后病理学评估后被诊断患有癌症的轨道 2a 中的患者将被纳入意向治疗分析。

数据收集和质量评估 根据丹麦有关个人数据的法律，研究人员将寻求丹麦数据保护局对该试验的批准。 数据处理将根据敏感个人信息处理法、通用数据保护条例 (GDPR) 和数据保护法进行。 研究人员还将寻求研究伦理委员会和丹麦药品管理局对该试验的批准。

每个患者的数据将被连续记录并写入试验开始前准备的表格 (CRF)。 在招聘会议期间，研究人员将使用纸质工作表获取基线数据和纳入/排除标准。 在治疗性内窥镜检查期间，研究者将使用纸质工作表收集数据；之后数据将使用 Easytrial 平台输入电子数据库。 所有其他数据将直接记录到电子 Easytrial 数据库中。 纸质工作表将以可识别的方式存储在各个研究地点的上锁柜子中。 所有收集的数据都将有源文档。

数据将作为个人身份信息存储 10 年，之后于 2029 年 2 月 1 日删除。 数据将按照 GDPR 的规定存储在 Teamsite（安全数据存储）。

如果患者退出研究，收集的数据将被匿名化。 如果患者要求删除收集到的数据，则会执行此操作。

临床试验质量管理规范和质量评估 本试验是根据丹麦药品法第 88 条第 2 节和 2006 年 6 月 29 日第 744 号良好临床试验规范指令进行的。 该试验将由丹麦首都地区的良好临床实践 (GCP) 单位监督。 干预研究中现有的质量保证和控制程序将通过项目开始、中期和结束时的预定监测协议得到遵循。 在丹麦药品管理局、GCP 部门或其他相关当局的审计、监测和/或检查中，这些都将被允许对存储的数据和信息进行相关访问。

伦理方面的考虑 本研究是根据赫尔辛基宣言和 2011 年 6 月 14 日关于研究伦理委员会关于健康研究试验的做法的丹麦法律 593 进行的。 该项目已获得部门管理层、丹麦数据保护局 (REG-010-2019)、区域研究伦理委员会 (编号 SJ-753) 和丹麦药品管理局 (2019-000131-51) 的批准。 该研究已在 EudraCT（编号 2019-000131-51）注册，并将在 www.clinicaltrials.gov 注册。 试验将由当地 GCP 单位监督。 任何可能影响研究的实施、患者的潜在益处或可能影响患者安全的方案的修改，包括研究目标、研究设计、患者人群、样本量、研究程序或重要管理方面的变化，都需要议定书的正式修正案。 修正案将由研究小组商定，并需要在实施前获得伦理委员会和其他主管部门的批准（如果适用）。

该研究将在外科、Herlev 医院和新西兰大学医院进行。 这将有助于阐明结肠肿瘤和周围正常粘膜的局部抗生素治疗在结肠癌和结肠腺瘤的治疗中是否有一席之地。

研究患者在收到口头和书面信息并获得书面同意后被纳入。 在任何时候，患者都可以撤回他们的同意，而不会损害他们与研究者或相关医生的关系，也不会影响他们在科室的治疗。 所有患者都可以从临床负责医生那里获得有关该项目的更多信息。

患者将被告知研究中发现的任何其他健康信息。

资金和保险 DMSc Ismail Gögenur（发起人）、MD Hans Raskov（研究员）、MD Mahdi Alamili（研究员）和 MD Astrid Bennedsen（首席研究员）发起了该项目。 研究者和申办者在本研究中没有经济利益或利益冲突。 Reponex Pharmaceuticals A/S (Slotsmarken 12, 1.th.DK-2970 Hørsholm) 将向参与部门分发试验药物和结肠镜，并支付 MD Hans Raskov 和 MD Astrid Bennedsen 的工资费用以及试验的运行费用. 资金来源在本研究的设计中没有任何作用，在其执行、分析、数据解释或决定提交结果的过程中也不会发挥任何作用。

有关外部资助的信息包含在给患者的书面信息中。

保险 患者可享受外科、Herlev 医院和新西兰大学医院现有的住院患者保险（患者保险计划）。

发表研究成果 正面、负面和不确定的研究结果将发表在国际同行评审期刊上。 研究伦理委员会和丹麦药品管理局将在最后一位患者最后一次就诊后的 90 天内收到通知，最终报告将在 12 个月内在 EUDRA 数据库中报告。

试验终止后不迟于 12 个月，将提交一篇包含所获结果的文章，以在国际公认的具有高影响力的同行评审期刊上发表。 研究人员希望从该研究中获得三篇出版物；详细描述方法的可行性出版物、结肠癌患者干预结果的出版物以及结肠腺瘤患者的出版物。 作者资格将基于国际医学期刊编辑委员会 (ICMJE) 的指南。