Účinek polymorfismu CYP2C19 při eradikaci Helicobacter Pylori

Úvod:

H. pylori byl prohlášen a ratifikován jako karcinogen I Světovou zdravotnickou organizací (WHO) Mezinárodní agenturou pro výzkum rakoviny (IARC). Celosvětově první linie terapie eradikace doporučená pro H. pylori, kombinuje inhibitor protonové pumpy (PPI) se dvěma antibiotiky (amoxicilinem a klarithromycinem nebo metronidazolem). Dnes je však účinnost této terapie méně než 75% "procento", a to především díky rezistenci H. pylori na antibiotika. Dalšími faktory, které se podílejí na selhání léčby, jsou adherence k léčbě a genetické faktory hostitele, které mohou ovlivnit farmakokinetiku léků, konkrétně farmakokinetika PPI PPI hraje zásadní roli v eradikačních terapiích, potlačuje hluboce kyselou sekreci a zvyšuje tak potenciál vodíkových iontů (pH) nad 6,0. To umožňuje H. pylori replikovat se aktivněji, než když je pH žaludku nižší než 6,0, a proto zlepšuje antibiotickou aktivitu a podporuje větší stabilitu antimikrobiálního činidla a koncentraci antibiotika v žaludku. Účinek PPI závisí na jeho metabolismu enzymy cytochromu P450 (CYP). Nedávné studie ukázaly, že genotyp CYP2C19 může ovlivnit schopnost PPI potlačovat sekreci kyseliny v žaludku, jak bylo pozorováno u omeprazolu. Omeprazol je metabolizován CYP2C19 (90 % "procento") a CYP3A4 (10 % "procento"). Gen CYP2C19 má 21 polymorfismů, z nichž tři hrají důležitou roli v metabolismu PPI. V závislosti na polymorfismu jsou tedy označováni jako časní metabolizátoři (EM) ("hvězdička"*1/"hvězdička"*1), střední metabolizátoři (IM) ("hvězdička"*1/"hvězdička"*X) a pomalí metabolizátoři ( PM) ("hvězdička"*X/"hvězdička"*X). Kde alela "hvězdička"*1 je alela divokého typu ("divoký typ") a "hvězdička"*X odpovídá mutované alele. Pacienti s genotypem CYP2C19 "hvězdička"*1/"hvězdička"*2 o "hvězdička" *1/"hvězdička"*3 jsou IM a pacienti s genotypem CYP2C19 "hvězdička"*2/"hvězdička"*2 nebo CYP2C19 "hvězdička" *3/"hvězdička"*3 jsou PM. Přítomnost polymorfismů CYP2C19 „hvězdička“*2 a „hvězdička“*3 CYP2C19 předpovídá fenotyp jednotlivých metabolizátorů. V roce 2006 byla nalezena alela CYP2C19 „hvězdička“*17, jejíž funkce je klinicky důležitá, protože heterozygoti s formami CYP2C19 „hvězdička“*1/“hvězdička“*17 jsou jinými autory jednoduše považováni za ultrarychlé metabolizátory. Klinické důsledky tohoto posledně jmenovaného polymorfismu se opírají o následující: pokud jsou PPI rychle metabolizovány, standardní dávka PPI nedokáže adekvátně potlačit sekreci kyseliny a eradikační terapie H. pylori bude méně účinná, pokud je mikroorganismus citlivý na antibiotika. Nedávná práce v Kolumbii zaměřená na eradikaci H. pylori pomocí trojité terapie s klarithromycinem nebo levofloxacinem v kombinaci s amoxicilinem uvádí, že ačkoli byl organismus na tato antibiotika citlivý, dosažená eradikace byla různá. Tyto výsledky mohou naznačovat možnost, že účinnost léčby v naší populaci mohou ovlivnit další faktory, odlišné od antimikrobiální rezistence.

Obecné metody:

Cílem této práce bylo zjistit vliv genetického polymorfismu CYP2C19 na eradikaci H. pylori. Za tímto účelem byla provedena randomizovaná jednoduchá zaslepená klinická studie. To se konalo od roku 2012 do roku 2015 v Bogotě v Kolumbii. Studie byla provedena v souladu s pokyny správné klinické praxe a etickými zásadami Helsinské deklarace. Etická komise zúčastněných institucí schválila protokol studie, kde všichni účastníci podepsali písemný informovaný souhlas.

Po získání informovaného souhlasu bylo k účasti ve studii pozváno 356 pacientů. Všichni zařazení účastníci podstoupili úvodní endoskopii, provedenou v horní endoskopické službě, klinickém centru z Bogoty, DC, Kolumbie, aby získali biopsii žaludku pro histologii, mikrobiologický a genotypový test. Vzhledem k navrženým přísným kritériím pro zařazení a vyloučení však z 356 účastníků bylo do studie zahrnuto pouze 133.

Všichni účastníci studie podstoupili endoskopii horní části trávicího traktu za aseptických podmínek s minimálně šestihodinovým hladověním. Během endoskopie bylo odebráno pět biopsií z antra a čtyři biopsie z těla pro histopatologii, mikrobiologii a molekulární analýzu. Pro histopatologickou analýzu byly vzorky biopsie odeslány na patologii v oddělených řádně označených nádobách. Pro mikrobiologické a molekulární analýzy byly odebrány tři antrální a tři biopsie těla žaludku a použity následovně: jedna biopsie z antra pro rychlý ureázový test, dvě biopsie (antrum a jedna z těla žaludku) pro kultivaci H. pylori a citlivost test. Kultivace byla prováděna pouze tehdy, když jeden nebo oba dodatečné testy byly pozitivní na H. pylori. Pokud byla kultura negativní, ale jakékoli další testy byly pozitivní, detekce mikroorganismu byla potvrzena analýzou molekulární biologie (detekce genu ureA H. pylori). Mělo se za to, že účastník byl infikován H. pylori, když byly dva nebo více testů pozitivní. Další biopsie byla použita pro extrakci DNA a následnou analýzu genetického polymorfismu CYP2C19.

Kultivace byla provedena z biopsií účastníků, jejichž rychlý ureázový test a histologie byly pozitivní, z biopsie antra a těla žaludku na Brucella agaru (BD) obohaceném o 7% "procento" v/v koňské krve, Isovitalex (BD) a Helicobacter Pylori selektivní doplněk (Dent) (oxoid). Poté byly vzorky inkubovány při 37 °C s 11% "procentuálním" oxidem uhličitým (CO2) po dobu 3 až 5 dnů. Test citlivosti na antibiotika z čistých kolonií byl proveden ředěním agaru (metoda zlatého standardu) podle Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) pro stanovení minimální inhibiční koncentrace amoxicilinu a klarithromycinu (MIC). Kromě toho byl u všech 133 pacientů zahrnutých do této studie identifikován polymorfismus CYP2C19 „hvězdička“*1,“hvězdička“*2,“hvězdička“*3 a „hvězdička“*17. Pro tento návrh byla DNA získána z biopsií žaludku izolací DNA z lidských vzorků z komerční soupravy (QIAGEN) a poté byla provedena identifikace příslušných polymorfismů.

Polymorfismy CYP2C19 "hvězdička"*1,"hvězdička"*2,"hvězdička"*3 byly stanoveny polymerázovou řetězovou reakcí v reálném čase (RT-PCR) pomocí sady Modular Assays pro lidský CYP2C19"hvězdička"*2 a CYP2C19"hvězdička" *3 (Roche), podle pokynů výrobce. A nested PCR a polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) byly provedeny pro stanovení alely "hvězdička"*17 podle Baldwina et al. zpráva.

Vzhledem k tomu, že studie porovnávala dva typy terapií, bylo 133 pacientů náhodně rozděleno do dvou skupin pomocí počítačového programu. Skupina jedna nebo konvenční skupina a skupina 2 nebo personalizovaná skupina. Obě skupiny dostávaly amoxicilin a klarithromycin, ale první skupina dostávala standardní dávky omeprazolu a ve druhé skupině se dávky omeprazolu upravovaly podle polymorfismu CYP2C19 každého účastníka.

Po provedení mikrobiologického a molekulárního testování byli účastníci zařazeni do léčebného režimu podle randomizované zkřížené sekvence poskytnuté počítačem generovaným randomizačním seznamem. Účastníci byli telefonicky kontaktováni za účelem přidělení termínu ošetření dle přidělené skupiny.

Všichni účastníci dostali podrobné informace o nežádoucích účincích, které se mohou vyskytnout u různých léků. Ověření možných nežádoucích účinků bylo provedeno telefonicky pomocí ověřeného a předem nakódovaného dotazníku, který obsahoval následující příznaky: průjem, kovová chuť, nevolnost, pocit nafouknutí, ztráta chuti k jídlu, zvracení, bolesti břicha, zácpa a vyrážka. Intenzita každého symptomu byla odstupňována od nuly do tří: 0: nepřítomný, 3: závažný, pomocí Likertovy škály. Nakonec byla eradikace H. pylori ověřena 8 týdnů po léčbě antigenovým testem (Meridian®). Pro tento test byl od každého účastníka požadován vzorek stolice. Test byl proveden podle pokynů výrobce.

Pro analýzu výsledků byla vytvořena databáze účastníků v excelu a v spss. Tyto databáze obsahovaly obecné charakteristiky každého účastníka, výsledek každého z mikrobiologických testů, molekulární biologii. Byla provedena popisná statistika a analýza účinnosti použitých léčebných postupů.