Assoziation von SNPs in der langen intergenen nichtkodierenden RNA 00511 (LINC00511) mit Brustkrebs in der ägyptischen Bevölkerung

1. Einleitung 1.1. Hintergrund: Brustkrebs (BC) ist heutzutage eine der häufigsten Krebsarten bei Frauen, da weltweit jedes Jahr schätzungsweise 1,6 Millionen Fälle von Brustkrebs auftreten. Jährlich sterben etwa 500.000 Frauen an den Folgen von BC, was es zu einer der Hauptursachen für die Krebssterblichkeit bei Frauen macht. Es macht 23 % aller Krebsfälle und 14 % aller Krebstodesfälle bei Frauen aus. Es macht 52 % der BC-Fälle und 62 % der Todesfälle in wirtschaftlich entwickelten Ländern aus. In Ägypten ist BC Berichten zufolge die häufigste Krebsart bei Frauen (38,8 %), und die altersbereinigte BC-Rate beträgt 49,6 pro 100.000 Bevölkerung. Brustkrebs kann basierend auf den Hormonen und dem HER2-Status in Luminal A BC (Östrogenrezeptor (ER) +, Progesteronrezeptor (PR) +/-, humaner epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor 2 (HER2) -) und Luminal B BC (ER+) eingeteilt werden , PR+/-, HER2 +), HER2 BC (ER-, PR- und HER2+) und dreifach negatives BC (TNBC) (ER-, PR- und HER2-). TNBC ist aufgrund seines Wiederauftretens ein aggressiver Krebs und weniger gezielt Medikamente. BC kann zu metastasierendem Krebs werden und auf entfernte Organe wie Knochen, Lunge und Gehirn übertragen werden, was die Ursache für seine Unheilbarkeit ist. Eine frühzeitige Diagnose der Krankheit führt zu einer guten Prognose und einer Erhöhung der Überlebensrate. Traditionelle Prognosefaktoren wie Tumorgröße, Tumorgrad und Lymphknotenmetastasierungsstatus sind die wichtigsten Prognosefaktoren für BC. Für die Prognose ist jedoch die Einbeziehung der genetischen Informationen erforderlich. Als typischer Krebs entsteht BC aufgrund des Zusammenspiels genetischer und nichtgenetischer Faktoren.

   Es wurde berichtet, dass lange nichtkodierende RNAs (lncRNAs) bei verschiedenen Krebsarten, einschließlich BC, eine wichtige Rolle spielen, indem sie die Genexpression und epigenetische Signaturen regulieren. LncRNAs sind länger als 200 Nukleotide. LncRNAs durchlaufen verschiedene biologische Wirkungen, wie z. B. die Regulierung der RNA-Stabilität, die Transkriptionsregulation, die Funktion als Gerüst, RNA-Enhancer, miRNA-Sequestrierung und die Steuerung der Protein-DNA-Interaktion. LncRNAs sind auf vielen Ebenen an der Regulierung der Genexpression beteiligt, einschließlich alternativem Spleißen und der Änderung der Proteinlokalisierung, Chromatinmodifikation, Transkription und posttranskriptioneller Verarbeitung. Darüber hinaus sind lncRNAs an mehreren Kennzeichen von Krebs beteiligt, darunter unkontrollierte Proliferation, Angiogenese, die Vermeidung von Zelltod und Metastasierung. Es ist erwähnenswert, dass eine abnormale Expression von lncRNAs erheblich zur Krebsanfälligkeit und zum Fortschreiten bei BC-Fällen beiträgt.

   Die lange intergene nichtkodierende RNA 00511 (LINC00511) ist eine 2265 bp ncRNA und befindet sich auf Chromosom 17q24. Frühere Studien ergaben, dass es bei vielen Krebsarten wie BC, nichtkleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs und Gliom eine onkogene Funktion ausübt. In BC-Fällen fördert LINC00511 aufgrund seiner onkogenen Wirkung das Tumorwachstum, indem es den G1/S-Übergang beschleunigt und die Apoptose hemmt. Es wurde gezeigt, dass ein Zusammenhang zwischen LINC00511 und dem Wachstum und der Invasion von BC besteht, wobei die kompetitive Bindung zwischen LINC00511 und der microRNA-185 (miR-185) die Prognose und das Fortschreiten von BC beeinflusst. LINC00511 schwämmt miR-185-3p und verhindert, dass diese miRNA an ihre Ziel-mRNA bindet. Daher ist freie mRNA vorhanden, mit stärkerer Expression des Transkriptionsfaktors E2F1, der schließlich die BC-Proliferation und -Progression fördert.

   Es wurde festgestellt, dass genetische Variationen wie Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) in lncRNAs mit Krebs verbunden sind. Sie beeinflussen die Funktion von Zielgenen durch die Veränderung des Spleißprozesses und der Stabilität der mRNA-Konformation, was zu einer Modifikation ihrer nachgeschalteten Interaktionspartner führt. Mutierte Varianten können die Expression und Sekundärstruktur von lncRNAs beeinflussen, was sich auf den Status der Bindungsstelle(n) für miRNAs auswirken und darüber hinaus die Interaktion zwischen miRNAs und mRNAs verändern kann. SNPs in lncRNAs können je nach Funktion der lncRNA das Krebsrisiko erhöhen oder verringern, da sie als Onkogen oder Tumorsuppressor-Gen wirken können, eine Hypothese, die noch untersucht werden muss. Darüber hinaus können SNPs in lncRNAs das Krebsrisiko erhöhen oder verringern, je nachdem, wo sich diese SNPs befinden, ob sie sich in einem nichtkodierenden Bereich befinden oder nicht. Die Identifizierung solcher Loci, ob mutiert oder nicht, die an der Progression oder Prävention von BC beteiligt sind, wird ein wichtiges Thema für das Verständnis der BC-Pathogenese sowie für die Entdeckung neuer Ziele für die Krebsdiagnose, -prävention und/oder -behandlung sein.

   1.2 Ziel der Arbeit Bereitstellung von Informationen über die Rolle von LINC00511-SNPs (rs11657109 oder rs17780195 oder rs9906859, rs4432291 und rs1558535) bei der BC-Anfälligkeit.

   1.3 Ergebnisse früherer Studien Chong et al. fanden heraus, dass in der chinesischen Bevölkerung ein Zusammenhang zwischen LINC00511-SNPs und BC bestand. Wir haben die gleichen Zusammenhänge untersucht, jedoch in unserer ägyptischen Bevölkerung.

2. Probanden 2.1 Ethik-Erklärung Eine ethische Genehmigung wurde von der Ain Shams University eingeholt, Genehmigung des Forschungsethikausschusses der Fakultät für Pharmazie (REC ID 6, Datum: 11. November 2020). Die Studie wurde gemäß den Richtlinien der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Von allen Teilnehmern wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.

   2.2 Power-Analyse und Stichprobengrößenberechnungen Die Berechnung der Stichprobengröße erfolgte mit der Software PS: Power and Sample Size Calculations, Version 3.0.11 für MS Windows (William D. Dupont und Walton D., Vanderbilt University, Nashville, Tennessee, USA). Der α-Fehlerpegel wurde auf 0,05 festgelegt, die Leistung wurde auf 80 % eingestellt. Die minimale optimale Stichprobengröße sollte 85 Teilnehmer für jede SNP-Gruppe betragen.

   2.3 Studienteilnehmer werden in zwei Hauptgruppen eingeteilt

   • Fallgruppe n = 267, weibliche BC-Patienten vom National Cancer Institute (NCI), Kairo, Ägypten.
   • Kontrollgruppe n = 150, gesunde weibliche Freiwillige. Klinische Daten wurden aus medizinischen Unterlagen und den ursprünglichen Pathologieberichten gewonnen. Die folgenden Datenparameter wurden aufgezeichnet und ausgewertet: Alter des Patienten, Tumorgröße (durch Mammographie oder Magnetresonanztechnik definierter Durchmesser (mm oder cm) bei Diagnose), anfängliches Tumorstadium, BIRADs-Klassifizierung gemäß dem American College of Radiology und Knotenstatus gemäß der TNM-Klassifikation des American Joint Committee on Cancer (AJCC).
3. Methoden 3.1 Blutentnahme Blutproben (5 ml) wurden von Kontrollpersonen und BC-Patienten auf EDTA-Antikoagulans-Vakutainern entnommen und bis zur biochemischen Beurteilung bei -20 °C gelagert.

3.2 Die biochemische Bewertung wurde im Labor der Abteilung für Pharmakologie und Biochemie der Fakultät für Pharmazie der British University in Egypt und im Forschungslabor für fortgeschrittene Biochemie der Fakultät für Pharmazie der Ain Shams University durchgeführt.

3.3 DNA-Extraktion Ein DNA-Extraktionskit (QIAamp DNA Blood Mini Kit) (Kat. Nr. 51104; Zymo Research, USA) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet, um DNA aus Vollblut zu extrahieren, das auf EDTA-Antikoagulans-Vacutainern gesammelt wurde.

3.4 DNA-Quantifizierung Die Durchführung erfolgte mit einem Quawell UV-Vis-Spektrophotometer Q5000 (USA). 3.5 SNPs Genotyping TaqMan® SNP genotyping assay was used to perform genotyping for LINC00511 polymorphisms (rs11657109 or rs17780195 or rs9906859 or rs4432291 and rs1558535) through using the TaqMan Universal Master Mix No UNG (Thermo Fisher Scientific, USA) and StepOnePlus™ qPCR system (Applied Biosysteme, USA).

3.6 Statistische Analyse Zur Durchführung aller statistischen Analysen wurden die Software Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) v.23.0 und die SHEsis-Software verwendet. Der Student-t-Test und der χ 2 -Test wurden verwendet, um quantitative und qualitative Variablen zwischen Fällen bzw. Kontrollgruppen zu vergleichen. Die logistische Regression wurde angewendet, um den Zusammenhang zwischen LINC00511-SNPs und der BC-Anfälligkeit herauszufinden. Eine geschichtete Analyse wurde angewendet, um den Zusammenhang zwischen LINC00511-SNPs und der BC-Anfälligkeit weiter zu untersuchen. Um mehr über den Zusammenhang zwischen BC-Anfälligkeit und LINC00511-SNPs herauszufinden, wurde eine geschichtete Analyse verwendet. Für die Haplotypanalyse wurde die SHEsis-Software verwendet, um die kombinierte Wirkung der untersuchten SNPs zu testen.

Analysen mit einem P-Wert kleiner oder gleich 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.