Associação de SNPs em RNA não codificante intergênico longo 00511 (LINC00511) com câncer de mama entre a população egípcia

1. Introdução 1.1. Antecedentes: O câncer de mama (CM) é um dos tipos de câncer mais comuns em mulheres atualmente, pois estima-se que 1,6 milhão de casos de CM ocorram em todo o mundo a cada ano. Aproximadamente 500.000 mulheres morrem devido ao BC anualmente, tornando-o uma das principais causas de mortalidade por câncer entre as mulheres. Representa 23% do total de casos de câncer e 14% das mortes por câncer em mulheres. Representa 52% dos casos de CM e 62% das mortes nos países economicamente em desenvolvimento. No Egito, o CM é relatado como o câncer mais frequente em mulheres (38,8%) e a taxa de CM ajustada à idade é de 49,6 por 100.000 população. O câncer de mama pode ser classificado com base nos hormônios e no status de HER2 em Luminal A BC (receptor de estrogênio (ER) +, receptor de progesterona (PR) +/-, receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2) -), Luminal B BC (ER + , PR+/-, HER2 +), HER2 BC (ER-, PR- e HER2+) e BC triplo negativo (TNBC) (ER-, PR- e HER2-).TNBC é um câncer agressivo devido à sua recorrência e menos alvo medicação. O BC pode se tornar um câncer metastático e ser transferido para órgãos distantes, como ossos, pulmão e cérebro, o que é a causa de sua incurabilidade. O diagnóstico precoce da doença leva a um bom prognóstico e ao aumento da taxa de sobrevivência. Fatores prognósticos tradicionais, como tamanho do tumor, grau do tumor e status de metástase linfonodal, são os fatores prognósticos mais importantes para CM. No entanto, a inclusão da informação genética é necessária no prognóstico. Como um câncer típico, o CM ocorre devido à interação de fatores genéticos e não genéticos.

   Foi relatado que RNAs não codificantes longos (lncRNAs) desempenham um papel importante em diferentes tipos de câncer, incluindo o CM, através da regulação da expressão gênica e assinaturas epigenéticas. LncRNAs têm mais de 200 nucleotídeos de comprimento. Os LncRNAs sofrem diferentes ações biológicas, como regulação da estabilidade do RNA, regulação transcricional, atuação como andaime, intensificador de RNA, sequestro de miRNA e orientação da interação proteína-DNA. Os LncRNAs estão implicados na regulação da expressão gênica em muitos níveis, incluindo splicing alternativo e alteração da localização da proteína, modificação da cromatina, transcrição e processamento pós-transcricional. Além disso, os lncRNAs estão envolvidos em várias características do câncer, incluindo proliferação descontrolada, angiogênese, evasão da morte celular e metástase. Vale ressaltar que a expressão anormal de lncRNAs contribui significativamente para a suscetibilidade e progressão do câncer em casos de CM.

   O RNA não codificante intergênico longo 00511 (LINC00511) é um ncRNA de 2.265 pb e está localizado no cromossomo 17q24. Estudos anteriores descobriram que exerce uma função oncogênica em muitos tipos de câncer, como BC, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de ovário e glioma. Nos casos de BC, por ser oncogênico, o LINC00511 promove o crescimento tumoral acelerando a transição G1/S e inibindo a apoptose. Foi demonstrado que existe uma associação entre o LINC00511 e o crescimento e invasão do BC, onde a ligação competitiva entre o LINC00511 e o microRNA-185 (miR-185) afeta o prognóstico e a progressão do BC. LINC00511 esponja o miR-185-3p impedindo que este miRNA se ligue ao seu mRNA alvo, portanto, o mRNA livre está presente, com mais expressão do fator de transcrição E2F1, que eventualmente promove a proliferação e progressão do BC.

   Descobriu-se que variações genéticas, como polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em lncRNAs, estão associadas ao câncer. Eles afetam a função dos genes alvo, através da alteração do processo de splicing e estabilidade da conformação do mRNA, levando à modificação de seus parceiros de interação a jusante. Variantes mutantes podem afetar a expressão e a estrutura secundária dos lncRNAs, o que pode afetar o status do(s) sítio(s) de ligação dos miRNAs, além de alterar a interação entre miRNAs e mRNAs. SNPs em lncRNAs podem aumentar ou reduzir o risco de câncer, dependendo da função do lncRNA, pois pode atuar como oncogene ou gene supressor de tumor, hipótese a ser explorada. Além disso, os SNPs nos lncRNAs podem aumentar ou reduzir o risco de câncer, dependendo da localização desses SNPs, se em uma área não codificante ou não. A identificação de tais loci, sejam eles mutantes ou não, envolvidos na progressão ou prevenção do CM, será uma questão importante para a compreensão da patogênese do CM, bem como para a descoberta de novos alvos para diagnóstico, prevenção e/ou tratamento do câncer.

   1.2 Objetivo do Trabalho Fornecer informações sobre o papel dos SNPs LINC00511 (rs11657109 ou rs17780195 ou rs9906859, rs4432291 e rs1558535) na suscetibilidade ao BC.

   1.3 Resultados de estudos anteriores Chong et al. descobriram que havia uma associação entre SNPs LINC00511 e BC na população chinesa. estudamos as mesmas associações, mas em nossa população egípcia.

2. Sujeitos 2.1 Declaração de Ética Uma aprovação ética foi obtida da Ain Shams University, conselho de revisão da Faculdade de Farmácia, aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (REC ID 6, data: 11 de novembro de 2020). O estudo foi conduzido de acordo com as Diretrizes da Declaração de Helsinque. Um consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes.

   2.2 Análise de poder e cálculos de tamanho de amostra O cálculo do tamanho de amostra foi feito usando o software PS: Power and Sample Size Calculations, versão 3.0.11 para MS Windows (William D. Dupont e Walton D., Vanderbilt University, Nashville, Tennessee, EUA). O nível de erro α foi fixado em 0,05, o poder foi fixado em 80%. O tamanho mínimo ideal da amostra deve ser de 85 participantes para cada grupo SNP.

   2.3 Os participantes do estudo serão classificados em dois grupos principais

   • Grupo de casos n= 267, pacientes do sexo feminino com BC do Instituto Nacional do Câncer (NCI), Cairo, Egito.
   • Grupo controle n= 150, voluntárias saudáveis. Os dados clínicos foram obtidos dos prontuários médicos e dos laudos patológicos originais. Os seguintes parâmetros de dados foram registrados e avaliados: idade do paciente, tamanho do tumor (definido por mamografia ou técnicas de ressonância magnética diâmetro (mm ou cm) no diagnóstico), estágio inicial do tumor, classificação BIRADs de acordo com o American College of Radiology e status nodal de acordo com a classificação TNM do American Joint Committee on Cancer (AJCC).
3. Métodos 3.1 Coleta de sangue Amostras de sangue (5 ml) foram coletadas de controles e pacientes com CM, em vacutainers com anticoagulante EDTA e armazenadas a -20º C até a avaliação bioquímica.

3.2 A avaliação bioquímica foi realizada no Laboratório do Departamento de Farmacologia e Bioquímica da Faculdade de Farmácia da Universidade Britânica no Egito e no Laboratório de Pesquisa em Bioquímica Avançada da Faculdade de Farmácia da Universidade Ain Shams.

3.3 Extração de DNA Um Kit de Extração de DNA (QIAamp DNA Blood Mini Kit) (Cat. Nº 51104; Zymo Research, EUA) foi utilizado para extrair DNA de sangue total coletado em vacutainers anticoagulantes com EDTA, de acordo com as instruções do fabricante.

3.4 Quantificação de DNA Foi feito utilizando um espectrofotômetro Quawell UV-Vis Q5000 (EUA). 3.5 Genotipagem de SNPs O ensaio de genotipagem TaqMan® SNP foi usado para realizar genotipagem para polimorfismos LINC00511 (rs11657109 ou rs17780195 ou rs9906859 ou rs4432291 e rs1558535) através do uso do sistema TaqMan Universal Master Mix No UNG (Thermo Fisher Scientific, EUA) e StepOnePlus™ qPCR (Aplicado Biossistemas, EUA).

3.6 Análise estatística O software Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) v.23.0 e o software SHEsis foram utilizados para realizar todas as análises estatísticas. O teste t de Student e o teste do χ 2 foram utilizados para comparar variáveis ​​quantitativas e qualitativas entre casos e grupos controle, respectivamente. A regressão logística foi aplicada para descobrir a associação entre os SNPs LINC00511 e a suscetibilidade ao BC. Uma análise estratificada foi aplicada para investigar melhor a relação entre os SNPs LINC00511 e a suscetibilidade ao BC. Para saber mais sobre a relação entre a suscetibilidade ao BC e os SNPs LINC00511, foi utilizada uma análise estratificada. O software SHEsis foi utilizado para fazer a análise de haplótipos para testar o efeito combinado dos SNPs estudados.

Análises com valor de P menor ou igual a 0,05 foram consideradas estatisticamente significativas.