Associazione degli SNP nell'RNA non codificante intergenico lungo 00511 (LINC00511) con il cancro al seno nella popolazione egiziana

1. Introduzione 1.1. Background: Il cancro al seno (BC) è uno dei tipi di cancro più comuni nelle donne al giorno d'oggi poiché si stima che ogni anno si verifichino 1,6 milioni di casi di BC in tutto il mondo. Ogni anno muoiono circa 500.000 donne a causa del BC, rendendolo una delle principali cause di mortalità per cancro tra le donne. Rappresenta il 23% del totale dei casi di cancro e il 14% delle morti per cancro nelle donne. Rappresenta il 52% dei casi di BC e il 62% dei decessi nei paesi economicamente in via di sviluppo. In Egitto, il cancro al seno è considerato il cancro più frequente nelle donne (38,8%) e il tasso di cancro al seno aggiustato per età è 49,6 per 100.000 popolazione. Il cancro al seno può essere classificato in base agli ormoni e allo stato HER2 in Luminale A BC (recettore degli estrogeni (ER) +, recettore del progesterone (PR) +/-, recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER2) -), luminale B BC (ER+ , PR+/-, HER2 +), HER2 BC (ER-, PR- e HER2+) e BC triplo negativo (TNBC) (ER-, PR- e HER2-). Il TNBC è un cancro aggressivo a causa della sua recidiva e del minor numero di tumori mirati medicinali. Il BC può diventare un cancro metastatico e trasferirsi in organi distanti come ossa, polmoni e cervello, causando la sua incurabilità. La diagnosi precoce della malattia porta ad una buona prognosi e ad un aumento del tasso di sopravvivenza. I fattori prognostici tradizionali, come le dimensioni del tumore, il grado del tumore e lo stato delle metastasi linfonodali, sono i fattori prognostici più importanti per il BC. Tuttavia, nella prognosi è necessario includere le informazioni genetiche. Come un tipico cancro, il BC si verifica a causa dell'interazione di fattori genetici e non genetici.

   È stato riportato che gli RNA lunghi non codificanti (lncRNA) svolgono un ruolo importante in diversi tipi di cancro, incluso il BC, attraverso la regolazione dell'espressione genica e delle firme epigenetiche. Gli LncRNA hanno una lunghezza maggiore di 200 nucleotidi. Gli LncRNA subiscono diverse azioni biologiche, come la regolazione della stabilità dell'RNA, la regolazione trascrizionale, la funzione di impalcatura, il potenziamento dell'RNA, il sequestro dei miRNA e la guida dell'interazione proteina-DNA. Gli LncRNA sono implicati nella regolazione dell'espressione genica a molti livelli, inclusi lo splicing alternativo e il cambiamento della localizzazione delle proteine, la modificazione della cromatina, la trascrizione e l'elaborazione post-trascrizionale. Inoltre, gli lncRNA sono coinvolti in diversi aspetti caratteristici del cancro, tra cui la proliferazione incontrollata, l’angiogenesi, l’elusione della morte cellulare e la metastasi. È interessante notare che l'espressione anormale degli lncRNA contribuisce in modo significativo alla suscettibilità e alla progressione del cancro nei casi di BC.

   L'RNA intergenico lungo non codificante 00511 (LINC00511) è un ncRNA di 2265 bp e si trova sul cromosoma 17q24. Studi precedenti avevano scoperto che esercita una funzione oncogenica in molti tumori, come il cancro del polmone non a piccole cellule, il cancro dell’ovaio e il glioma. Nei casi di BC, essendo oncogenico, LINC00511 promuove la crescita del tumore accelerando la transizione G1/S e inibendo l'apoptosi. È stato dimostrato che esiste un'associazione tra LINC00511 e crescita e invasione del BC, dove il legame competitivo tra LINC00511 e il microRNA-185 (miR-185) influenza la prognosi e la progressione del BC. LINC00511 spugne miR-185-3p che impediscono a questo miRNA di legarsi al suo mRNA bersaglio, quindi è presente mRNA libero, con maggiore espressione del fattore di trascrizione E2F1, che alla fine promuove la proliferazione e la progressione del BC.

   È stato scoperto che variazioni genetiche come i polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) negli lncRNA sono associati al cancro. Influenzano la funzione dei geni bersaglio, attraverso l'alterazione del processo di splicing e la stabilità della conformazione dell'mRNA, portando alla modifica dei loro partner interagenti a valle. Le varianti mutanti possono influenzare l'espressione e la struttura secondaria degli lncRNA, che possono influenzare lo stato dei siti di legame per i miRNA, inoltre, alterando l'interazione tra miRNA e mRNA. Gli SNP negli lncRNA possono aumentare o ridurre il rischio di cancro, a seconda della funzione dell'lncRNA, poiché potrebbe agire come oncogene o gene soppressore del tumore, un'ipotesi da esplorare. Inoltre, gli SNP negli lncRNA possono aumentare o ridurre il rischio di cancro, a seconda della posizione di questi SNP, se in un'area non codificante o meno. L'identificazione di tali loci, mutanti o meno, coinvolti nella progressione o nella prevenzione del cancro, sarà un problema importante per comprendere la patogenesi del cancro e per scoprire nuovi bersagli per la diagnosi, la prevenzione e/o il trattamento del cancro.

   1.2 Scopo del lavoro Fornire informazioni sul ruolo degli SNP LINC00511 (rs11657109 o rs17780195 o rs9906859, rs4432291 e rs1558535) nella suscettibilità al BC.

   1.3 Risultati di studi precedenti Chong et al. hanno scoperto che esisteva un'associazione tra SNP LINC00511 e BC nella popolazione cinese. abbiamo studiato le stesse associazioni ma nella nostra popolazione egiziana.

2. Argomenti 2.1 Dichiarazione etica Un'approvazione etica è stata ottenuta dall'Università di Ain Shams, approvazione del Comitato di revisione della Facoltà di Farmacia e del Comitato etico per la ricerca (REC ID 6, data: 11 novembre 2020). Lo studio è stato condotto in conformità alle linee guida della Dichiarazione di Helsinki. È stato raccolto un consenso informato scritto da tutti i partecipanti.

   2.2 Analisi della potenza e calcoli della dimensione del campione Il calcolo della dimensione del campione è stato effettuato utilizzando il software PS: Power and Sample Size Calculations, versione 3.0.11 per MS Windows (William D. Dupont e Walton D., Vanderbilt University, Nashville, Tennessee, USA). Il livello di errore α è stato fissato a 0,05, la potenza all'80%. La dimensione minima ottimale del campione dovrebbe essere di 85 partecipanti per ciascun gruppo SNP.

   2.3 I partecipanti allo studio saranno classificati in due gruppi principali

   • Gruppo di casi n = 267, pazienti di sesso femminile BC del National Cancer Institute (NCI), Il Cairo, Egitto.
   • Gruppo di controlli n= 150, volontarie sane. I dati clinici sono stati ottenuti dalle cartelle cliniche e dai referti patologici originali. Sono stati registrati e valutati i seguenti parametri di dati: età del paziente, dimensione del tumore (definita dalla mammografia o dalle tecniche di risonanza magnetica diametro (mm o cm) alla diagnosi), stadio iniziale del tumore, classificazione BIRAD secondo l'American College of Radiology e stato linfonodale secondo la classificazione TNM dell’American Joint Committee on Cancer (AJCC).
3. Metodi 3.1 Prelievo di sangue Campioni di sangue (5 ml) sono stati raccolti da controlli e pazienti con BC, su vacutainer anticoagulanti EDTA e conservati a -20º C fino alla valutazione biochimica.

3.2 La valutazione biochimica è stata eseguita nel laboratorio del Dipartimento di farmacologia e biochimica della Facoltà di Farmacia, Università britannica in Egitto e nel laboratorio di ricerca di biochimica avanzata presso la Facoltà di Farmacia, Università di Ain Shams.

3.3 Estrazione del DNA Un kit di estrazione del DNA (QIAamp DNA Blood Mini Kit) (cat. N. 51104; Zymo Research, USA) è stato utilizzato per estrarre il DNA dal sangue intero raccolto su vacutainer anticoagulanti EDTA, secondo le istruzioni del produttore.

3.4 Quantificazione del DNA È stata effettuata utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis Quawell Q5000 (USA). 3.5 Genotipizzazione degli SNP Il test di genotipizzazione TaqMan® SNP è stato utilizzato per eseguire la genotipizzazione dei polimorfismi LINC00511 (rs11657109 o rs17780195 o rs9906859 o rs4432291 e rs1558535) utilizzando TaqMan Universal Master Mix No UNG (Thermo Fisher Scientific, USA) e StepOnePlus™ qPCR sistema (applicato Biosistemi, Stati Uniti).

3.6 Analisi statistica Il software Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) v.23.0 e il software SHEsis sono stati utilizzati per eseguire tutte le analisi statistiche. Il test t di Student e il test χ2 sono stati utilizzati per confrontare le variabili quantitative e qualitative tra casi e gruppi di controllo, rispettivamente. È stata applicata la regressione logistica per scoprire l'associazione tra SNP LINC00511 e suscettibilità al BC. È stata applicata un'analisi stratificata per studiare ulteriormente la relazione tra SNP LINC00511 e suscettibilità al BC. Per saperne di più sulla relazione tra suscettibilità al BC e SNP LINC00511, è stata utilizzata un'analisi stratificata. Il software SHEsis è stato utilizzato per eseguire l'analisi dell'aplotipo per testare l'effetto combinato degli SNP studiati.

Le analisi con valore P inferiore o uguale a 0,05 sono state considerate statisticamente significative.