Stowarzyszenie SNP w długim międzygenowym niekodującym RNA 00511 (LINC00511) z rakiem piersi w populacji egipskiej

1. Wprowadzenie 1.1. Wstęp: Rak piersi (BC) jest obecnie jednym z najpowszechniejszych typów nowotworów u kobiet. Szacuje się, że każdego roku na świecie występuje 1,6 miliona przypadków raka piersi. Co roku na BC umiera około 500 000 kobiet, co czyni tę chorobę główną przyczyną umieralności na raka wśród kobiet. Stanowi 23% wszystkich przypadków raka i 14% zgonów z powodu nowotworów u kobiet. Stanowi 52% przypadków BC i 62% zgonów w krajach rozwijających się gospodarczo. W Egipcie BC jest najczęstszym nowotworem u kobiet (38,8%), a wskaźnik BC skorygowany względem wieku wynosi 49,6 na 100 000 populacja. Rak piersi można sklasyfikować na podstawie hormonów i statusu HER2 na luminalny A BC (receptor estrogenowy (ER) +, receptor progesteronowy (PR) +/-, receptor ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2) -), luminalny B BC (ER+) , PR+/-, HER2 +), HER2 BC (ER-, PR- i HER2+) oraz potrójnie ujemne BC (TNBC) (ER-, PR- i HER2-).TNBC jest nowotworem agresywnym ze względu na jego nawrotowość i mniejszą liczbę celów ukierunkowanych leki. BC może przekształcić się w nowotwór z przerzutami i przenieść się do odległych narządów, takich jak kości, płuca i mózg, co jest przyczyną jego nieuleczalności. Wczesne rozpoznanie choroby pozwala na dobre rokowanie i zwiększenie przeżywalności. Tradycyjne czynniki prognostyczne, takie jak wielkość guza, jego stopień i stan przerzutów do węzłów chłonnych, są najważniejszymi czynnikami prognostycznymi dla BC. Jednak w prognozowaniu potrzebne jest uwzględnienie informacji genetycznej. Jako typowy nowotwór, BC występuje w wyniku interakcji czynników genetycznych i pozagenetycznych.

   Donoszono, że długie niekodujące RNA (lncRNA) odgrywają ważną rolę w różnych typach nowotworów, w tym BC, poprzez regulację ekspresji genów i sygnatur epigenetycznych. LncRNA mają długość większą niż 200 nukleotydów. LncRNA podlegają różnym działaniom biologicznym, takim jak regulacja stabilności RNA, regulacja transkrypcji, działanie jako rusztowanie, wzmacniacz RNA, sekwestracja miRNA i kierowanie interakcją białko-DNA. LncRNA biorą udział w regulacji ekspresji genów na wielu poziomach, w tym w alternatywnym splicingu i zmianie lokalizacji białek, modyfikacji chromatyny, transkrypcji i przetwarzaniu potranskrypcyjnym. Co więcej, lncRNA biorą udział w kilku cechach charakterystycznych raka, w tym w niekontrolowanej proliferacji, angiogenezie, unikaniu śmierci komórkowej i przerzutach. Warto wspomnieć, że nieprawidłowa ekspresja lncRNA znacząco przyczynia się do podatności na raka i progresji w przypadkach BC.

   Długi międzygenowy niekodujący RNA 00511 (LINC00511) to ncRNA o długości 2265 bp, zlokalizowany na chromosomie 17q24. Poprzednie badania wykazały, że pełni on funkcję onkogenną w wielu nowotworach, takich jak BC, niedrobnokomórkowy rak płuc, rak jajnika i glejak. W przypadkach BC, ponieważ jest onkogenny, LINC00511 sprzyja wzrostowi nowotworu poprzez przyspieszanie przejścia G1/S i hamowanie apoptozy. Wykazano, że istnieje związek pomiędzy LINC00511 a wzrostem i inwazją BC, gdzie konkurencyjne wiązanie pomiędzy LINC00511 i mikroRNA-185 (miR-185) wpływa na rokowanie i progresję BC. LINC00511 gąbki miR-185-3p zapobiegają wiązaniu się tego miRNA z docelowym mRNA, w związku z czym występuje tam wolne mRNA z większą ekspresją czynnika transkrypcyjnego E2F1, co ostatecznie sprzyja proliferacji i progresji BC.

   Stwierdzono, że różnice genetyczne, takie jak polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP) w lncRNA, są powiązane z rakiem. Wpływają na funkcję genów docelowych poprzez zmianę procesu splicingu i stabilności konformacji mRNA, prowadząc do modyfikacji ich dalszych partnerów wchodzących w interakcję. Zmutowane warianty mogą wpływać na ekspresję i strukturę drugorzędową lncRNA, co może wpływać na stan miejsca (miejsc) wiązania miRNA, a ponadto zmieniając interakcję między miRNA i mRNA. SNP w lncRNA mogą zwiększać lub zmniejszać ryzyko raka, w zależności od funkcji lncRNA, ponieważ może on działać jako onkogen lub gen supresorowy nowotworu, co jest hipotezą do zbadania. Co więcej, SNP w lncRNA mogą zwiększać lub zmniejszać ryzyko raka, w zależności od lokalizacji tych SNP, czy znajdują się w obszarze niekodującym, czy nie. Identyfikacja takich loci, zmutowanych lub nie, zaangażowanych w progresję lub zapobieganie BC, będzie ważną kwestią dla zrozumienia patogenezy BC, jak również dla odkrycia nowych celów w diagnostyce raka, zapobieganiu i/lub leczeniu.

   1.2 Cel pracy Dostarczenie informacji na temat roli SNP LINC00511 (rs11657109 lub rs17780195 lub rs9906859, rs4432291 i rs1558535) w podatności na BC.

   1.3 Wyniki poprzednich badań Chong i in. odkryli, że istnieje związek między SNP LINC00511 a BC w populacji chińskiej. badaliśmy te same skojarzenia, ale w naszej populacji egipskiej.

2. Przedmioty 2.1 Oświadczenie dotyczące etyki Uzyskano zgodę etyczną od Uniwersytetu Ain Shams, komisji rewizyjnej Wydziału Farmacji, akceptację Komisji ds. Etyki ds. Badań Naukowych (REC ID 6, data: 11 listopada 2020 r.). Badanie przeprowadzono zgodnie z Deklaracją Wytycznych Helsińskich. Od wszystkich uczestników uzyskano pisemną świadomą zgodę.

   2.2 Analiza mocy i obliczenia wielkości próbki Obliczenia wielkości próbki wykonano przy użyciu oprogramowania PS: Power and Sample Size Calculations, wersja 3.0.11 dla MS Windows (William D. Dupont i Walton D., Vanderbilt University, Nashville, Tennessee, USA). Poziom błędu α ustalono na 0,05, moc na 80%. Minimalna optymalna wielkość próby powinna wynosić 85 uczestników dla każdej grupy SNP.

   2.3 Uczestnicy badania zostaną podzieleni na dwie główne grupy

   • Grupa przypadków n= 267, pacjentki BC z Krajowego Instytutu Onkologii (NCI), Kair, Egipt.
   • Grupa kontrolna n= 150, zdrowe ochotniczki. Dane kliniczne uzyskano z dokumentacji medycznej i oryginalnych raportów patologicznych. Rejestrowano i oceniano następujące parametry danych: wiek pacjenta, wielkość guza (określana średnicą (mm lub cm) w momencie rozpoznania za pomocą mammografii lub rezonansu magnetycznego), początkowe stadium nowotworu, klasyfikacja BIRAD według American College of Radiology oraz stan węzłów chłonnych. zgodnie z klasyfikacją TNM Amerykańskiego Wspólnego Komitetu ds. Raka (AJCC).
3. Metody 3.1 Pobieranie krwi Próbki krwi (5 ml) pobrano od kontroli i pacjentów z BC, w pojemnikach próżniowych z antykoagulantem EDTA i przechowywano w temperaturze -20°C do czasu oceny biochemicznej.

3.2 Ocenę biochemiczną przeprowadzono w Laboratorium Wydziału Farmakologii i Biochemii na Wydziale Farmacji Uniwersytetu Brytyjskiego w Egipcie oraz w laboratorium badań zaawansowanej biochemii na wydziale farmacji Uniwersytetu Ain Shams.

3.3 Ekstrakcja DNA Zestaw do ekstrakcji DNA (zestaw QIAamp DNA Blood Mini Kit) (nr kat. nr 51104; Zymo Research, USA) zastosowano do ekstrakcji DNA z pełnej krwi pobranej w próżniowych pojemnikach z antykoagulantem EDTA, zgodnie z instrukcją producenta.

3.4 Kwantyfikacja DNA Dokonano tego przy użyciu spektrofotometru Quawell UV-Vis Q5000 (USA). 3.5 Genotypowanie SNP Test genotypowania SNP TaqMan® wykorzystano do genotypowania polimorfizmów LINC00511 (rs11657109 lub rs17780195 lub rs9906859 lub rs4432291 i rs1558535) przy użyciu TaqMan Universal Master Mix nr UNG (Thermo Fisher Scientific, USA) i StepOnePlus™ System qPCR (stosowany Biosystems, USA).

3.6 Analiza statystyczna Do wykonania wszystkich analiz statystycznych wykorzystano pakiet statystyczny dla nauk społecznych (SPSS) v.23.0 oraz program SHEsis. Do porównania zmiennych ilościowych i jakościowych odpowiednio pomiędzy przypadkami i grupami kontrolnymi wykorzystano test t-Studenta i test χ2. Zastosowano regresję logistyczną, aby znaleźć związek między SNP LINC00511 a podatnością na BC. W celu dalszego zbadania związku między SNP LINC00511 a podatnością na BC zastosowano analizę warstwową. Aby dowiedzieć się więcej na temat związku między podatnością BC a SNP LINC00511, zastosowano analizę warstwową. Do analizy haplotypów w celu przetestowania łącznego efektu badanych SNP wykorzystano oprogramowanie SHEsis.

Analizy, w których wartość P była mniejsza lub równa 0,05, uznano za istotne statystycznie.