La metformina reduce la tasa de recaída en pacientes con leucemia linfoblástica aguda de precursores de células B (Ph+ negativo)

Los genes MDR (Multidrug-Resistance) están implicados en la resistencia de varios tipos de cáncer. Los más importantes en la leucemia son ABCB1 y ABCG2- ABCB1 están implicados en la resistencia y la gravedad de la leucemia mieloide aguda y la leucemia linfoblástica aguda pediátrica. Esos transportadores usan ATP para su uso. La metformina disminuye la reserva intracelular de ATP (trifosfato de adenosina) mediante la activación de AMPK. Recientemente, en la línea celular de cáncer MCF7-Adr (Michigan Cancer Foundation 7, línea celular de cáncer de mama), la metformina bloqueó la función de la glicoproteína P mediante la inhibición del factor nuclear -kappa-B.

La evidencia clínica en este momento es limitada, basada en pequeños ensayos clínicos o estudios observacionales. Este estudio intenta evaluar el efecto de la adición de metformina a un régimen de quimioterapia estándar en pacientes que expresan altos niveles de expresión de ARNm (ácido ribonucleico mensajero) ABCB1

protocolo experimental

Los pacientes se estratificarán en tres grupos: los de alta expresión, los de baja expresión y los de ausencia de expresión génica según el nivel de ARNm de ABCB1 en el momento del diagnóstico. Las muestras se obtienen a partir de células mononucleares de sangre periférica.

Extracción de ARN total El ARN total se aisló mediante TRIzol® (Invtirogen Life Technologies) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante descritas por Chomczynski y Sacchi.

La concentración y pureza del ARN total se determinó en un espectrofotómetro UV-vis (Thermo Scientific, Genesis 10S UV-vis). La integridad del material genético se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5% a 70 V durante 40 min. El ARN se almacenó a -80°C hasta que se necesitó.

Síntesis de ADNc Para la síntesis de ADNc (ácido desoxirribonucleico complementario) la cantidad de ARN utilizada fue de 2 µg para un volumen final de 20 µg. El ARN se mezcló con 1 µl de oligonucleótido 12-18 (INVITROGEN, Carlsbad, CA) y 1 µl de dNTPs (desoxinucleósido trifosfato) 10 mM (Applied Biosystems, Roche). Luego de agregar 4 µl de Buffer 5 X (Tris-HCl (ácido clorhídrico) 250mM, KCl (cloruro de potasio) 375 mM MgCl2 15mM), 2 µl de DTT (ditiotreitol) (0.1M) y agua, se incubó toda la mezcla. a 37° durante dos minutos y 1 µl de enzima transcriptasa inversa MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) (200 u) (INVITROGEN, Carlsbad, CA) e incubado a 37°C durante 50 minutos.

Análisis de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) Los niveles de expresión de ARNm de los genes ABCB1 (Hs01069047) y gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; Hs00985689) se midieron mediante el ensayo de expresión génica TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City , CA, EE. UU.). El gen GAPDH se utilizó como control endógeno y cada muestra se analizó por triplicado. Los niveles de expresión relativa se calcularon utilizando el método 2-ΔΔCt con médula ósea como calibrador. Los puntos de corte de alta y baja expresión fueron determinados por los valores medios observados en donantes sanos.

Protocolo de tratamiento Todos los pacientes reciben un tratamiento de inducción remisión con una fase inicial de preinducción con esteroides (prednisona) desde el día -7 al día -1 (-7 ,-6 = 25 mg , -5 , -4 : 50 mg , -3, -2: 75 mg y el día -1: 100 mg). El tratamiento de inducción a la remisión se basa en un tratamiento de 28 días con prednisona (60 mg/m2), vincristina (1,5 mg/m2 máximo 2 mg) y daunorrubicina 60 mg/m2 los días +1, +8 y +15. Si el paciente logra una Remisión Completa, continúa con una terapia de consolidación con bloques secuenciales de tratamiento que incluye Citarabina, Etopósido, Metotrexato. Si el paciente sigue en remisión al final de la terapia de consolidación continúa en la fase de mantenimiento que incluye 6-mercaptopurina y una dosis semanal de metotrexato durante unos dos años

Respuesta Al día 28 del tratamiento de inducción a la remisión, según el resultado de la muestra de médula ósea, los pacientes serán declarados en remisión (menos del 5% de blastos) o refractarios (>5% de células blásticas). Si el paciente presenta en algún momento del tratamiento un aumento en el recuento de blastos en la médula ósea, se considera que el paciente está en recaída.