Metformin reduziert die Rückfallrate bei Patienten mit B-Zell-Vorläufer (Ph+ negativ) akuter lymphoblastischer Leukämie

Die MDR-Gene (Multidrug-Resistance) sind an der Resistenz mehrerer Krebsarten beteiligt. Die wichtigsten bei Leukämie sind ABCB1 und ABCG2. ABCB1 sind mit der Resistenz und dem Schweregrad der akuten myeloischen Leukämie und der pädiatrischen akuten lymphoblastischen Leukämie verbunden. Diese Transporter verwenden ATP zur Verwendung. Metformin verringert die intrazelluläre ATP (Adenosintriphosphat)-Reserve durch die Aktivierung von AMPK. Kürzlich blockiert Metformin auf der Krebszelllinie MCF7-Adr (Michigan Cancer Foundation 7, Brustkrebszelllinie) die Funktion des P-Glykoproteins durch die Hemmung des Kernfaktors -kappa-B.

Die klinische Evidenz ist derzeit begrenzt und basiert auf kleinen klinischen Studien oder Beobachtungsstudien. Diese Studie versucht, die Wirkung der Zugabe von Metformin zu einem Standard-Chemotherapieschema bei Patienten zu bewerten, die ein hohes Maß an Expression von mRNA (Messenger-Ribonukleinsäure) ABCB1 aufweisen

Versuchsprotokoll

Die Patienten werden in drei Gruppen stratifiziert: Die Genexpression mit hoher Expression, niedrige Expression und fehlende Genexpression gemäß dem Niveau der mRNA von ABCB1 bei der Diagnose. Die Proben werden aus mononukleären peripheren Blutzellen gewonnen

Extraktion von Gesamt-RNA Gesamt-RNA wurde mit TRIzol® (Invtirogen Life Technologies) gemäß den von Chomczynski und Sacchi beschriebenen Empfehlungen des Herstellers isoliert.

Die Konzentration und Reinheit der Gesamt-RNA wurde in einem UV-Vis-Spektrophotometer (Thermo Scientific, Genesis 10S UV-Vis) bestimmt. Die Integrität des genetischen Materials wurde durch 1,5 % Agarose-Gelelektrophorese bei 70 V für 40 min bestätigt. Die RNA wurde bis zur Verwendung bei –80°C gelagert.

Synthese von cDNA Für die Synthese von cDNA (komplementäre Desoxyribonukleinsäure) betrug die verwendete Menge an RNA 2 &mgr;g für ein Endvolumen von 20 &mgr;g. Die RNA wurde mit 1 &mgr;l Oligonukleotid 12–18 (INVITROGEN, Carlsbad, CA) und 1 &mgr;l de dNTPs (Desoxynukleosidtriphosphat) 10 mM (Applied Biosystems, Roche) gemischt. Nach Zugabe von 4 µl Puffer 5 X (Tris-HCl (Salzsäure) 250 mM, KCl (Kaliumchlorid) 375 mM MgCl2 15 mM), 2 µl DTT (Dithiothreitol) (0,1 M) und Wasser wurde die gesamte Mischung inkubiert bei 37°C für zwei Minuten und 1 &mgr;l MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) Reverse Transkriptase-Enzym (200 u) (INVITROGEN, Carlsbad, CA) und 50 Minuten bei 37°C inkubiert.

Echtzeit-Analyse der Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) Die mRNA-Expressionsniveaus der Gene ABCB1 (Hs01069047) und Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH; Hs00985689) wurden unter Verwendung des TaqMan®-Genexpressionsassays (Applied Biosystems, Foster City , CA, USA). Das GAPDH-Gen wurde als endogene Kontrolle verwendet und jede Probe wurde dreifach analysiert. Die relativen Expressionsniveaus wurden unter Verwendung der 2-ΔΔCt-Methode mit Knochenmark als Kalibrator berechnet. Die hohen und niedrigen Expressionsgrenzwerte wurden durch die Mittelwerte bestimmt, die bei gesunden Spendern beobachtet wurden.

Behandlungsprotokoll Alle Patienten erhalten eine Induktions-Remissionsbehandlung mit einer anfänglichen Präinduktionsphase mit Steroiden (Prednison) von Tag -7 bis Tag -1 (-7, -6 = 25 mg, -5, -4: 50 mg, -3, -2: 75 mg und am Tag -1: 100 mg). Die Induktionsremissionsbehandlung basiert auf einer 28-tägigen Behandlung mit Prednison (60 mg/m2), Vincristin (1,5 mg/m2, maximal 2 mg) und Daunorubicin 60 mg/m2 an den Tagen +1, +8 und +15. Wenn der Patient eine vollständige Remission erreicht, wird mit einer Konsolidierungstherapie mit aufeinanderfolgenden Behandlungsblöcken fortgefahren, die Cytarabin, Etoposid und Methotrexat umfassen. Wenn der Patient am Ende der Konsolidierungstherapie immer noch in Remission ist, wird die Therapie in einer Erhaltungsphase fortgesetzt, die 6-Mercaptopurin und eine wöchentliche Dosis Methotrexat für etwa zwei Jahre umfasst

Reaktion Am 28. Tag der Induktionsremissionsbehandlung werden die Patienten gemäß dem Ergebnis der Knochenmarkprobe für remissioniert (weniger als 5 % Blasten) oder refraktär (> 5 % Blastenzellen) erklärt. Wenn der Patient zu irgendeinem Zeitpunkt der Behandlung einen Anstieg der Anzahl der Knochenmarkblasten aufweist, gilt der Patient als rückfällig.